针对上述问题，中南大学武明花教授团队设计出一种pH响应型铜基金属-有机框架纳米颗粒Cu-MOF@DPCPX，可在酸性肿瘤微环境中降解释放Cu²⁺。释放的铜离子一方面耗竭谷胱甘肽、诱导脂酰化蛋白聚集和Fe-S簇丢失，触发铜死亡；另一方面通过类芬顿反应产生羟基自由基并下调GPX4，诱导铁死亡；同时引发的线粒体损伤激活线粒体自噬，进一步释放被隔离的铜，形成自我放大的死亡级联。该纳米平台在乳腺癌、肺癌、胰腺癌及胶质瘤等多种小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，并重编程免疫微环境（增加CD8⁺T细胞浸润、促进M1型巨噬细胞极化），为基于金属离子的多模式肿瘤治疗提供了新范式。该文章于2025年11月6日以《A Functional Nanocomposite Tri-Activates Cuproptosis,Ferroptosis,and Mitophagy Death Pathway to Oppose Malignancies》为题发表于《Advanced Healthcare Materials》（DOI：10.1002/adhm.202503530）。

图1.Cu- MOF @ DPCPX 的合成过程示意图及其针对TME激活癌症治疗的三重路径激活策略

（1）Cu-MOF@DPCPX的制备与表征

Cu-MOF@DPCPX呈八面体，TEM测得粒径35.6 nm，PXRD证实DPCPX负载后晶体结构完整；Zeta电位由+30.4 mV降至+19.8 mV，DLS尺寸由35.6 nm微增至38.9 nm（图2B–E）。FTIR在1710、1650 cm⁻¹出现DPCPX的C=O新峰，UV-Vis在276 nm出现DPCPX吸收且蓝移，元素mapping显示Cu、C、N、O均匀分布（图1F–H）。XPS给出Cu 2p、N 1s特征峰，Cu⁺/Cu²⁺面积比40.9/59.1%，N 1s分峰证实C–N与N–H配置，载药量30.7%（图1I–K）。酸响应实验：pH 7.4的PBS中48 h Cu²⁺释放仅15.7%，DPCPX释放64.7%，颗粒保持完整；pH 5.5或pH 5.5+10 mM GSH中24 h骨架碎裂，48 h Cu²⁺释放飙升至90.2%，水合粒径由30.4 nm降至3.1 nm，证实肿瘤微环境特异性崩解与药物释放（图3B–E）。

图2.Cu-MOF@DPCPX表征。（A）合成示意图；（B）TEM图像；（C）PXRD谱图；（D）Zeta电位；（E）水合粒径；（F）FTIR光谱；（G）UV-Vis吸收光谱；（H）元素分布图；（I）XPS全谱；（J）Cu 2p高分辨谱；（K）N 1s高分辨谱

图3.Cu-MOF@DPCPX催化性能。（A）催化机制示意图；（B）pH响应降解及GSH钝化示意图与TEM；（C）Cu释放曲线；（D）DPCPX释放曲线；（E）24 h水合粒径变化；（F）•OH检测示意图；（G）MB吸光度时间曲线；（H）MB对比；（I）DMPO-ESR谱；（J）DTNB-GSH反应示意；（K）GSH/GSSG变化；（L）GSH消耗；（M）UV-Vis谱

（2）Cu-MOF@DPCPX的ROS生成能力

Cu-MOF@DPCPX在GSH与H₂O₂共存下催化亚甲蓝（MB）氧化为oxMB，661 nm吸光度下降，提示·OH生成（图3F）；GSH进一步加剧吸光度降低，表明其增强芬顿效应（图3G）。ESR捕获实验（5,6-DMPO）在Cu-MOF@DPCPX+H₂O₂+GSH体系中呈现1:2:2:1特征信号，确证·OH自由基存在（图3I）。DTNB检测显示，327 nm处TNB生成峰随时间递减（图3J、3L），同步出现GSSG（图3K），表明GSH被氧化为GSSG；Cu-MOF自身341 nm吸收峰消失并在276 nm出现新峰（图3D），佐证框架内Cu²⁺/Cu⁺循环介导的GSH耗竭。上述结果共同说明Cu-MOF@DPCPX通过GSH消耗-铜离子级联芬顿反应放大ROS生成。

（3）Cu-MOF@DPCPX的细胞毒性

四种肿瘤细胞系（4T1、LLC、GL261、PAN02）经Cu-MOF@DPCPX处理24 h后，IC₅₀依次为48.634 nM、66.588 nM、144.896 nM、127.014 nM，均低于同浓度Cu-MOF或DPCPX单药组（图4A）。EdU掺入与细胞计数显示DNA合成率下降，证实增殖受抑（图4B、4C）。Transwell及伤口愈合实验表明迁移与侵袭细胞数减少（图4D、4E）；集落形成实验显示克隆数目显著降低（图4F）。

图4 Cu-MOF@DPCPX的细胞毒性。（A）不同浓度DPCPX、Cu-MOF及Cu-MOF@DPCPX处理肿瘤细胞24 h后的细胞活力；（B）Cu-MOF@DPCPX处理24 h后肿瘤细胞的EdU阳性细胞数量；（C）Cu-MOF@DPCPX在不同时间梯度下对肿瘤细胞活性的影响；（D–E）Cu-MOF@DPCPX显著减少肿瘤细胞的侵袭数、迁移数及划痕愈合率；（F）Cu-MOF@DPCPX有效抑制肿瘤细胞克隆形成。数据以均值±SD表示（n=3），单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01

（4）Cu-MOF@DPCPX靶向线粒体损伤

在正常生理条件下，铜由特异性递送蛋白分送至胞质、线粒体、高尔基体及细胞核；线粒体可在过量时储存铜，缺乏时再释放以维持稳态。过载时，线粒体积聚的铜破坏功能并触发铜死亡（图5A）。Cu-MOF@DPCPX处理使肿瘤细胞内铜含量高于Cu-MOF组（图5B）。FITC标记的Cu-MOF@DPCPX与MitoTracker Red共定位重叠显著，且与LysoTracker无交叉，表明其特异性富集于线粒体（图5C）。透射电镜显示处理组线粒体嵴数量减少（图5D）。

图5.Cu-MOF@DPCPX靶向线粒体损伤。（A）示意图说明Cu-MOF@DPCPX靶向线粒体损伤。（B）肿瘤细胞在用Cu-MOF和Cu-MOF@DPCPX处理后的铜离子水平。（C）免疫荧光检测显示Cu-MOF@DPCPX在线粒体中表现出主要聚集，而不是在溶酶体中。（D）透射电子显微镜显示肿瘤细胞在用Cu-MOF@DPCPX处理后线粒体嵴数量减少。数据以均值±标准差表示(n=3)

（5）Cu-MOF@DPCPX三重激活细胞铜死亡、铁死亡和线粒体自噬

金属依赖性细胞死亡，例如细胞铜死亡和铁死亡，是由金属离子稳态失衡触发的。此外，最近的研究表明，线粒体自噬在一定程度上可以放大金属依赖性细胞死亡。为了研究铜过载是否触发涉及细胞铜死亡、铁死亡和线粒体自噬的级联反应，对用或不用Cu-MOF@DPCPX处理的肿瘤细胞进行了RNA测序分析。在Cu-MOF@DPCPX处理组与对照组的比较中，根据|log2FC|>1和p<0.05的标准，检测到5690个差异表达基因（DEGs）。其中，3026个基因上调，2664个基因下调（图6A）。值得注意的是，编码热休克70 kDa蛋白1B的Hspa1b基因和编码热休克70 kDa蛋白1A的Hspa1a基因均显著上调。热休克70 kDa蛋白（HSP70）的上调也是细胞铜死亡的一个显著标志。活性评分分析显示，显著差异表达的基因揭示Cu-MOF@DPCPX诱导的细胞死亡主要涉及铜死亡、铁死亡和线粒体自噬（图6B）。Cu-MOF@DPCPX诱导的细胞死亡通路相关的差异表达基因如图6C所示。

图6.用Cu-MOF@DPCPX处理的肿瘤细胞的转录组学分析。（A）火山图显示空白组和Cu-MOF@DPCPX处理组之间的差异表达基因（DEG）。（B）显示基于空白和Cu-MOF@DPCPX处理的肿瘤细胞的DEG的KEGG富集分析的桑基图。（C）描述与Cu-MOF@DPCPX诱导的细胞死亡途径相关的DEG的热图

铁死亡是由细胞膜上脂质过氧化物的积累所引发，这依赖于芬顿反应。铜离子已知是驱动芬顿反应的关键催化剂（Cu+H₂O→Cu+·OH+OH⁻）。与此机制一致，研究发现Cu-MOF@DPCPX处理显著增加了脂质过氧化速率（LPO）（图7A）。此外，通过蛋白质印迹法检测了铁死亡关键介质（GPX4和SLC7A11）和铜死亡（FDX1和HSP70）的表达。结果表明，Cu-MOF@DPCPX降低了GPX4、SLC7A11和FDX1的表达，但增加了HSP70的表达（图7B）。铜死亡和铁死亡的启动会激活线粒体自噬以清除受损的线粒体。然而，这个过程意外地释放了从降解细胞器中隔离的铜和铁离子，形成了一个自我维持的循环，加剧了这两种类型的调节性细胞死亡。为了定量评估线粒体自噬活性，进行了Mt-Keima测定。Cu-MOF@DPCPX处理后的细胞中红荧光强度升高，表明线粒体溶酶体形成增加，自噬通量增强（图7C）。透射电镜进一步证实了Cu-MOF@DPCPX引起的线粒体自噬增强，与对照组相比，Cu-MOF@DPCPX处理组的细胞中可见更多的线粒体自噬体和自噬溶酶体（图7D）。

图7.Cu-MOF@DPCPX三重激活Cuproptosis、Ferroptosis和Mitophagy。（A）Cu-MOF@DPCPX增加肿瘤细胞中的脂质过氧化（LPO）。（B）Western blot实验检测Cu-MOF@DPCPX处理组肿瘤细胞的铁死亡和Cuproptosis通路。（C）Cu-MOF@DPCPX处理组肿瘤细胞mt-Keima测定中线粒体自噬活性的代表性荧光图像。（D）Cu-MOF@DPCPX处理组肿瘤细胞线粒体自噬的代表性电子显微镜图像。LPO：脂质过氧化率。数据以均值±标准差表示。数据以均值±标准差表示（n=3）

综上所述，这些发现表明，由Cu-MOF@DPCPX引发的细胞内铜超载不仅会导致铜死亡，还会导致铁死亡和线粒体自噬。铜死亡和铁死亡均可导致线粒体损伤，受损线粒体通过线粒体自噬途径被降解，然而，在线粒体自噬过程中，受损线粒体中的铜离子再次被释放，这反过来加剧了铜死亡和铁死亡，同时损害了剩余的健康线粒体。

（6）Cu-MOF@DPCPX是肿瘤的潜在治疗药物

在4种同源小鼠模型（皮下4T1、LLC、PAN02及原位GL261）中，尾静脉注射Cu-MOF@DPCPX（2.56 mg/kg，隔天给药，共7次）后：ICG标记显示制剂注射2 h即在脑肿瘤区域富集，证实其跨血脑屏障靶向能力（图8B）；活体成像肿瘤荧光信号较PBS组显著减弱（图8C、8D）。LLC肿瘤H&E与免疫组化显示，处理组出现大片坏死，Ki67下降，COX2（铁死亡标志）及HSP70（铜死亡标志）上调（图8E）。免疫荧光示肿瘤内CD14⁺单核细胞及CD8⁺ T细胞浸润增加（图8F）；流式结果证实F4/80⁺CD86⁺ M1型巨噬细胞比例升高，CD8⁺ T细胞增多，CD4⁺ Treg比例降低，提示免疫抑制微环境被重编程。

图8.Cu-MOF@DPCPX体内级联治疗效应。（a）治疗时间轴：经尾静脉给予Cu-MOF@DPCPX（2.56 mg kg⁻¹，300 μL），隔日一次，共7次；（b）ICG标记的Cu-MOF@DPCPX在原位胶质瘤小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑）及皮下瘤的离体/活体荧光成像，显示肿瘤区域高富集；（c）Luciferase标记的胶质瘤小鼠在Day 0与Day 16的生物发光图，Cu-MOF@DPCPX组信号显著低于PBS组；（d）定量生物发光强度，Cu-MOF@DPCPX抑制率达82.4 %（n=5）；（e）H&E与免疫组化显示Cu-MOF@DPCPX组肿瘤细胞坏死区扩大，Ki-67下调，铁死亡驱动基因COX2上调，HSP70下调；（f）免疫荧光显示Cu-MOF@DPCPX组瘤内CD14⁺巨噬细胞浸润增加，CD4⁺与CD8⁺T细胞共浸润显著，提示免疫微环境重塑。数据以均值±SD表示（n=3），单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01