针对上述问题，同济大学医学院附属上海市第四人民医院郑加麟/谈扉团队受临床术式与药物靶向递送启发，构建了一种“双模”iNSC-Exo治疗平台：对需开颅的重型TBI，将外泌体载入3秒可注射、28天缓释的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠水凝胶（iNSC-Exo@Gel），实现损伤腔原位91%持续释放；对轻中型TBI，则用狂犬病毒糖蛋白RVG修饰外泌体，静脉给药后脑内富集度提高2倍。单细胞测序显示，两种途径均激活小胶质细胞亚群Microglia_Nrg3/Rarb的NRXN-Nlgn1轴，重建神经元-小胶质突触连接，从而统一解释跨场景疗效，为TBI提供兼顾手术与非手术患者的“通用型”外泌体精准治疗新范式。该文章于2025年9月24日以《Clinically Inspired Multimodal Treatment Using Induced Neural Stem Cells-Derived Exosomes Promotes Recovery of Traumatic Brain Injury through Microglial Modulation》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202508574）。

（1）神经球和外泌体的表征表明 iNSC-Exo 和 NSC-Exo 之间具有很强的相似性

为了评估外泌体对 TBI 恢复的治疗效果，分离了 NSC-Exo 和 iNSC-Exo 用于临床前研究（图 1A）。在悬浮培养中，NSC 和 iNSC 产生的神经球都表现出球形形态（图 1B）。这些神经球对神经干细胞标志物 Nestin（红色）和 SOX2（绿色）呈阳性（图 1C）。NSC-Exo 与 iNSC-Exo 均呈典型杯状/椭圆形态，粒径分别为 102 nm 与 150 nm（图 1D-E）；神经球 Nestin/SOX2 双阳性（图 1C）。CD81、CD63、CD9 高表达。PKH26 标记显示两种外泌体均可被 BV2（图 1F）及 PC12有效摄取，胞浆内荧光均匀分布；iNSC-Exo 摄取量与剂量呈正相关。

图1 神经球与外泌体的表征。(a) NSC-Exo与iNSC-Exo分离流程示意图；(b) 增殖条件下NSC与iNSC形成神经球的明场照片；(c) NSC与iNSC中SOX2和Nestin免疫荧光共标；(d) TEM显示NSC-Exo与iNSC-Exo呈杯状或椭圆形态；(e) NSC-Exo与iNSC-Exo的粒径分布；(f) PKH26标记的NSC-Exo及iNSC-Exo（红色）被BV2细胞摄取，DAPI染核（蓝色）

（2）iNSC-Exo 和 NSC-Exo 均抑制神经炎症并改善体外轴突生长

LPS刺激使BV2细胞M1标志物（CD86、TNF-α、iNOS）升高、M2标志物（CD206、TGF-β、IL4）降低；NSC-Exo与iNSC-Exo共培养后M1下调、M2上调，TNF-α蛋白减少、IL4增加（图2B-C）。划痕损伤PC12细胞中，NSC-Exo及iNSC-Exo均提升Nestin、NF-200、GAP-43转录水平并显著延长神经突长度，二者促轴突再生效应相当（图2E-G）。

图2 NSC-Exo与iNSC-Exo体外抑制神经炎症并促进轴突生长。(a) BV2细胞实验流程示意图；(b) Q-PCR检测M1/M2标志物CD86、TNF-α、iNOS、CD206、TGF-β、IL-4表达（n=6）；(c) 流式细胞术定量TNF-α与IL-4蛋白水平（n=6）；(d) PC12细胞划痕实验示意图；(e) Q-PCR检测GAP-43、NF-200、Nestin转录水平（n=6）；(f) GAP-43免疫荧光代表图及(g)神经突长度量化（n=50）

（3）开颅手术后并使用可注射水凝胶可以实现外泌体局部递送至 TBI 缺损

CMCS/SA/GDL 水凝胶 20 °C 下 547±98 s 完成原位成胶，孔隙互通，CMCS 氨基与 SA 羧基形成 3D 网络；初始分解温度 175 °C，4 周内脑内完全降解且无炎症反应。载外泌体 28 d 累计释放 91.45±16.27%，植入组荧光信号持续至第 21 天，显著优于单纯注射组，实现外泌体长效滞留。

（4）局部递送 iNSC-Exo 可保护小鼠 TBI 后血脑屏障，减少脑水肿，促进功能恢复

为了全面验证使用注射水凝胶（iNSC-Exo@Gel）局部递送的 iNSC-Exo 的治疗效果，进行了一系列神经学实验（图 3A）。术后第7天，iNSC-Exo@Gel与NSC-Exo@Gel均降低EB渗出量并减少脑水含量，H&E显示损伤面积缩小（图3B–E、H）。平衡木与转棒实验示，两治疗组错步率持续下降，转棒停留时间升至TBI组的1.5倍（图3F–G）。Iba-1、GFAP表达下调，GAP-43、DCX上调，提示炎症抑制与轴突再生；肝肾功能指标及主要脏器组织学无异常。

图3 开颅注射水凝胶递送外泌体。(a) 建模-给药-行为测试流程；(b) 术后7天EB渗出代表图及(c) 定量（n=3）；(d) 脑水含量（n=3）；(e) 28天H&E缺损区；(f) 平衡木错步率（n=6-9）；(g) 转棒停留时间（n=6-9）；(h) 损伤面积量化（n=3)

（5）RVG 改良策略通过体内 TBI 小鼠大脑的全身给药增强 iNSC-Exo 富集

静脉注射后，RVG-iNSC-Exo在脑内荧光信号强度于各时间点均高于未修饰iNSC-Exo，24与48 h离体脑半定量显示其脑蓄积量提升约2倍（图4A-D）；主要外周分布仍为肝、脾、肺（图4E-G）。DiD/FITC双标结果显示RVG-iNSC-Exo与Iba-1阳性微胶质细胞共定位，证实其被脑内微胶质细胞摄取（图4H）。

图4 RVG修饰提升iNSC-Exo脑富集。(a) 静脉注射后0.5–96 h活体脑DiD荧光；(b) 离体脑及主要器官24、48、96 h荧光图；(c) 脑荧光强度量化（n=5）；(d) 脑离体半定量（n=3）；肝、脾、肺等器官24 h (e)、48 h (f)、96 h (g)荧光强度；(h) Iba-1（红）共定位显示RVG-iNSC-Exo-FITC（绿）/DiD（黄）被微胶质细胞摄取

（6）全身给予 RVG 修饰的 iNSC-Exo 可改善小鼠 TBI 后运动功能，增加认知能力，增强认知恢复

RVG-iNSC-Exo组转棒停留时间及握力评分均高于未修饰组与TBI组（图5B–C）。Morris水迷宫5日训练中，RVG-iNSC-Exo组逃避潜伏期最短，空间策略占比提高，第6天探查试验目标象限停留时间与平台穿越次数均优于TBI组（图5D–H）。海马LFP显示，RVG-iNSC-Exo恢复θ、γ波段功率至对照水平（图5I–K）。组织学：RVG-iNSC-Exo组 lesion 面积缩小，组织结构完整，主要脏器无毒性改变。

图5 RVG-iNSC-Exo静脉给药提升TBI小鼠运动与认知恢复。(a) 实验时间轴；(b) 转棒成绩（n=6–9）；(c) 握力评分（n=6–9）；(d) 水迷宫学习期逃避潜伏期（n=6–9）；(e) 搜索策略分布；(f) 游泳轨迹图；(g) 目标象限停留时间与(h) 平台穿越次数（n=6–9）；(i) 海马LFP功率谱；(j) 时频图；(k) θ、γ波段功率量化（n=3）

（7）单细胞测序显示，小胶质细胞是 TBI 小鼠大脑中受 iNSC-Exo 治疗影响的主要细胞类型

损伤后第30天皮层-海马snRNA-seq共获113 802个细胞，分11型，iNSC-Exo组神经再生、学习记忆相关通路在三群神经元中显著上调（图6A-C）。细胞比例显示iNSC-Exo提高微胶质、少突胶质与星形胶质占比，Augur确定微胶质变化最显著（图6D-E；图S13）。微胶质进一步划分为Microglia_Nrg3、Mbp、Rarb、Atp1a2、Trem2五群，特征基因表达见UMAP（图6F-G）。

图6 单核测序显示iNSC-Exo主要影响微胶质。(a) UMAP展示11种细胞类群（n=9，3组各3例）；(b) 各型标记基因点图；(c) GSVA示3群神经元再生/学习记忆通路活性；(d) 细胞类型比例柱状图；(e) Augur AUC值棒棒糖图突出微胶质变化最大；(f) 五色UMAP划分5个微胶质亚群；(g) 各亚群特征基因表达UMAP图

（8）分化状态降低的Microglia_Nrg3 和Microglia_Rarb 亚群通过 iNSC-Exo 治疗介导神经修复功能

伪时序分析显示Microglia_Nrg3与Microglia_Rarb位于分化轨迹起始端，TBI组该两群密度增高而iNSC-Exo组恢复至对照水平（图7A-C）。CytoTRACE得分最高证实其低分化特性（图7E），差异表达分析亦显示该两群变化最显著（图7F）。GO/KEGG富集表明cluster 1基因集中于突触与轴突信号通路，相关基因在伪时序早期高表达（图7G-H）。

图7 低分化Microglia_Nrg3/Rarb介导iNSC-Exo修复。(a) Monocle伪时序轨迹（上：亚群，下：时间）；(b) 三组微胶质密度galaxy图；(c) 轨迹分组；(d) 伪时序基因表达ridge图及四簇热图；(e) CytoTRACE分化状态；(f) iNSC-Exo vs TBI差异基因；(g) cluster 1 GO/KEGG气泡图；(h) 突触/轴突基因表达动力学

（9）iNSC-Exo 治疗可通过激活 NRXN 信号通路改善小胶质细胞与神经元之间的突触连接

CellChat显示iNSC-Exo组微胶质-神经元互作数最高，Microglia_Nrg3/Rarb为主要信号发送者，传递强度优于TBI组（图8A–B）。NRXN-Nlgn1与NRG-Erbb4通路在TBI后减弱、iNSC-Exo后增强，信号流差异显著（图8C–E）。配体-受体互作图证实Microglia_Nrg3/Rarb通过Nrxn1-3及Nrg1-3与神经元突触蛋白结合，作用强度回升（图8F）。GSVA示该两群神经再生、发育及自噬功能上调；SCENIC鉴定Bclaf1、Foxp2转录因子调控NRXN/NRG，其regulon活性在iNSC-Exo组显著升高（图8G–H）。

图8 iNSC-Exo激活NRXN通路增强微胶质-神经元突触连接。(a) 细胞互作数差异热图；(b) 信号收发强度变化；(c) Microglia_Nrg3/Rarb信号差异；(d) NRXN与NRG互作网络；(e) 三组通路信号流堆叠图；(f) Microglia_Nrg3→神经元分子 dot 图；(g) GSVA 示三群神经元通路活性；(h) SCENIC 构建 NRXN/NRG 转录调控网络