针对上述问题，山东大学齐鲁医院张猛/张澄团队探讨了当心脏经历MI/R损伤时STING如何调节心肌铁死亡的分子机制。研究发现，I/R诱导的线粒体损伤导致dsDNA释放，随后被cGAS识别，导致第二信使cGAMP的产生和STING的激活，STING 可以通过与GPX4的相互作用直接触发心肌铁死亡。STING与GPX4结合，促使自噬增强，随后又反过来导致GPX4降解，从而促进心肌铁死亡。利用AAV介导的GPX4过表达和施用STING拮抗剂是针对MI/R损伤的有效治疗策略。研究强调STING作为预防MI/R损伤、改善患者预后和降低与缺血性心脏病相关的死亡率的潜在治疗靶点。该文章于2025年04月25日以《STING Aggravates Ferroptosis-Dependent Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Targeting GPX4 for Autophagic Degradation》为题发表于《Signal transduction and targeted therapy 》（DOI：10.1038/s41392-025-02216-9）。

（1）I/R引起心肌细胞中cGAS-STING信号上调

8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠 I/R 模型（图 1a、b）中，与假手术组相比，I/R 组心脏边界区域胞质双链 DNA（dsDNA）含量显著增加、cGAS 激活（图 1c），cGAS 和 STING 蛋白表达显著上调（图 1d、e），而梗死核心区和非缺血区的 cGAS、STING 蛋白水平无显著变化，免疫荧光结果证实 STING 在 I/R 边界区域表达增强。从 WT、cgas−/− 或 Sting−/− 小鼠心脏分离的细胞中，仅 I/R 边界区域的 CMs 出现 cGAS 和 STING 蛋白上调，cgas−/− 或 Sting−/− 小鼠的 CMs 中该上调效应不明显，成纤维细胞和巨噬细胞未观察到显著差异（图 1f、g），免疫荧光共定位进一步显示 I/R 心脏边界区域 CMs 的 STING 表达显著上调（图 1h）。体外实验中，小鼠原代 CMs（MPCs）缺氧 / 复氧（A/R）模型（图 1i）显示，与对照组相比，A/R 处理后 MPCs 线粒体严重损伤（表现为肿大、缩短、增厚），同时伴随 dsDNA 大量释放，胞质中出现不与细胞核或线粒体共定位的 dsDNA（图 1j）。

图1  I/R 诱导 CMs 中 cGAS-STING 上调。（a）小鼠 I/R 模型手术流程图；（b）小鼠 I/R 损伤模型示意图；（c）WT 小鼠 I/R 或假手术组心脏边缘区切片 dsDNA 与 cGAS 双免疫荧光分析；（d、e）WT 小鼠 I/R 或假手术组心脏边缘区分离细胞中 cGAS 和 STING 的 Western blot 检测及定量分析；（f、g）cgas−/−、Sting−/−及 WT 小鼠 I/R 或假手术组心脏边缘区不同细胞中 cGAS 和 STING 的 Western blot 检测及定量分析；（h）WT 小鼠 I/R 或假手术组心脏边缘区切片 CM 标志物与 STING 双免疫荧光分析；（i）CM 缺氧复氧（A/R）操作流程图；（j）A/R 后 MPCs 中 dsDNA 与线粒体双免疫荧光分析

（2）心肌细胞特异性敲除cGAS或STING显著减轻MI/R损伤

心肌细胞特异性cgas敲除（cgasfl/fl Myh6cre，cgas-CKO）和Sting敲除（Stingfl/fl Myh6cre，Sting-CKO）小鼠经构建用于MI/R损伤相关研究（图2a）；KO小鼠与对照小鼠基线左心室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS）无显著差异，不存在内在心功能异常。I/R后，cgas-CKO小鼠坏死面积减少、心功能（EF、FS）改善、纤维化面积降低（图2b–d），cgas或Sting-CKO小鼠再灌注7天的心肌纤维化程度同样减轻。体内I/R模型中，对照心肌细胞在生理状态下cGAS表达极低，I/R可诱导其表达，而cgas-CKO心肌细胞中该上调现象缺失（图2e）；Sting-CKO小鼠呈现类似结果（图2f–h），且I/R可诱导Stingfl/fl心肌细胞STING表达，Sting-CKO心肌细胞的STING蛋白水平不受I/R影响（图2i）。

图2 cGAS-STING缺失可减轻心肌I/R损伤。（a）cgas或Sting心肌细胞特异性条件性基因敲除小鼠结构示意图；b 心肌梗死面积及代表性组织切片；c 超声心动图及EF%、FS%测量；d Masson染色及纤维化面积百分比；e 心脏边界区心肌细胞cGAS的Western blot及定量；f 心肌梗死面积（占AAR百分比）及代表性组织切片；g 超声心动图及EF%、FS%测量；h Masson染色及纤维化面积百分比；i 心脏边界区心肌细胞STING的Western blot及定量

（3）STING通过调节氧化应激损伤加剧心肌铁死亡

Sting-CKO 小鼠与对照小鼠 I/R 后的心肌组织经 RNA 测序（图 3a），京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示差异表达基因（DEGs）显著富集于细胞生长和死亡通路（图 3b）；I/R 后心肌 Tunel 阳性细胞增多，而 cgas-CKO 和 Sting-CKO 小鼠的 Tunel 阳性细胞水平显著降低，但 Sting-CKO 小鼠与对照小鼠的凋亡标志物（Pro-caspase-3、Cleaved-caspase3、BCL-2）蛋白丰度无显著差异，表明 STING 缺失可减轻 I/R 后的心肌细胞死亡，但并非通过调控凋亡（图 3c）。基因本体论（GO）富集分析显示，与 Sting-CKO 小鼠相比，Stingfl/fl 小鼠 I/R 后心肌组织中自溶酶体相关、氧化应激及铁死亡信号通路相关基因富集更为显著（图 3d）。A/R 处理后，STING 可有效促进脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）生成，效果与阳性对照 Erastin 相当，且 STING 激活能阻断铁死亡抑制剂 Fer-1 对 MDA 的抑制作用（图 3e）；体外培养心肌细胞经 A/R 处理后活性氧（ROS）生成增加，Fer-1 预处理可降低 ROS 水平，而加入 cGAMP 激活 STING 后，Fer-1 对 ROS 的抑制作用显著受阻（图 3f）。Western blot 检测显示，Sting-CKO 小鼠 I/R 后心肌组织中酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4（ACSL4）、转铁蛋白受体（TFR）表达降低，谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）表达升高，溶质载体家族 7 成员 11（SLC7A11）无显著变化（图 3g、h），A/R 处理的心肌祖细胞（MPCs）中也证实铁死亡相关蛋白表达存在类似变化（图 3i、j），且 Sting 缺失可阻断 A/R 诱导的 GPX4 降解；qPCR 结果显示，I/R 后 Stingfl/fl 与 Sting-CKO 小鼠心肌组织中 gpx4 mRNA 水平无差异，提示 GPX4 蛋白减少源于翻译后调控而非转录水平下调。

图3 STING通过调控氧化应激损伤加剧心肌铁死亡。（a）I/R后用于RNA-seq的心脏区域示意图；（b）RNA-seq的KEGG富集条形图；（c）cgas-CKO、Sting-CKO及对照小鼠边界区心脏切片Tunel免疫荧光统计图；（d）RNA-seq的GO富集散点图；（e）脂质过氧化MDA分析；（f）MPC中ROS活细胞免疫荧光成像分析；（g,h）Stingfl/fl与Sting-CKO心肌细胞I/R后ACSL4、TFR、SLC7A11和GPX4的Western blot及定量；（i,j）Stingfl/fl与Sting-CKO的MPC在A/R或常氧条件下ACSL4、TFR、SLC7A11和GPX4的Western blot及定量

（4）STING直接靶向GPX4并与其相互作用

RNA-seq差异表达基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，铁死亡相关基因显著富集（图4a）；通过心肌干细胞（MPCs）中STING蛋白亲和抗体的串联亲和纯化、免疫沉淀产物银染（图4b i）及液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析（图4b ii），鉴定出铁死亡相关因子GPX4可能为STING的相互作用蛋白，分子对接预测STING（PDB ID: 4F5W）与GPX4（PDB ID: 5L71）存在10种潜在结合模式，Match-Align评分为8.157（图4c）。内源性免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，A/R后心肌细胞中内源性STING与GPX4形成复合物，cGAMP可进一步增强该复合物形成（图4d），且GPX4的内源性纯化产物中可检测到STING（图4e）；HeLa细胞中过表达Myc标签STING（Myc-STING）和Flag标签GPX4（Flag-GPX4）后，Myc或Flag IP实验显示两者存在相互作用（图4f、g），cGAMP处理可时间依赖性增强该相互作用，而Erastin则减弱其结合强度（图4h）。免疫染色结果显示，常氧条件下MPCs中STING低表达且与GPX4无共定位（图4i i），A/R后STING激活并与GPX4形成聚集点（图4i ii），cGAMP刺激后两者大量聚集并共定位（图4i iii），Erastin处理后共定位显著减少（图4i iv）；Stingfl/fl小鼠I/R心肌边界区STING表达升高且与GPX4共定位（图4j），而Sting-CKO小鼠中GPX4荧光增强且无STING共定位。

图4 GPX4靶向STING。（a）KEGG显示铁死亡通路富集；（b）MPCs A/R后使用STING亲和抗体进行串联亲和纯化的银染和LC-MS/MS分析；（c）STING与GPX4分子对接的十种潜在接触模式图像；（d）MPCs中内源性GPX4与STING相互作用及cGAMP短时刺激影响的Co-IP分析；（e）MPCs中内源性STING与GPX4相互作用及cGAMP短时刺激影响的Co-IP分析；（f）HeLa细胞中STING与GPX4相互作用的Co-IP分析；（g）HeLa细胞中GPX4与STING相互作用的Co-IP分析；（h）HeLa细胞中Erastin或cGAMP处理下GPX4与STING相互作用受cGAMP时间梯度或Erastin影响的Co-IP分析；（i）HeLa细胞中STING和GPX4共定位的双免疫荧光分析；（j）Stingfl/fl或Sting-CKO边界区心脏切片中GPX4和STING共定位的双免疫荧光分析

（5）STING与GPX4在GPX4的N146位点和STING的T267位点发生直接相互作用

基于蛋白质数据库（PDB）中 Apo STING（PDB ID: 4F5W）和 GPX4（PDB ID: 5L71）的相互作用预测，STING 可能通过 Y167、E260、Y245、Q266 或 T267 位点与 GPX4 的 G126、R127 或 N146 位点结合（图 5a）。HeLa 细胞中 Flag-GPX4 突变体与 Myc-STING 的 IP 实验显示，仅 Flag-GPX4-ΔN146 突变体丧失与 STING 的相互作用（图 5b）；Myc-STING 突变体实验中，仅 Myc-STING-ΔT267 突变体无法与 GPX4 结合（图 5c）。稳定过表达 Myc-STING 和 Flag-GPX4 的 HeLa 细胞中，STING 缺失 T267 位点或 GPX4 缺失 N146 位点时，两者共定位完全消失（图 5d）。超分辨成像显微镜（SIM）观察显示，转染 Myc-STING 和 Flag-GPX4 质粒的 HL-1 细胞中，两者存在强烈结合与共定位（图 5e）；cGAMP 可促进 STING-GPX4 复合物形成，但 Flag-GPX4-ΔN146 与 Myc-STING 共转染时，即使加入 cGAMP 也无法恢复共定位，证实 N146 和 T267 位点为两者相互作用的关键位点。

图5 STING与GPX4通过GPX4的N146和STING的T267氨基酸残基直接相互作用。（a）GPX4与STING潜在结合位点的分子对接图像；（b）HeLa细胞中Flag-GPX4及其点突变体与Myc-STING的Co-IP分析；（c）HeLa细胞中Flag-GPX4与Myc-STING及其点突变体的Co-IP分析；（d）HeLa细胞中STING与GPX4及其突变体共定位的双免疫荧光分析；（e）HL-1细胞中STING与GPX4在cGAMP处理下的共定位双免疫荧光分析

（6）STING通过自噬-溶酶体途径降解GPX4促进铁死亡

STING 可促进 GPX4 蛋白降解，该过程是铁死亡、活性氧（ROS）生成及脂质过氧化的关键环节。cGAMP（STING 激活剂）能降低 GPX4 蛋白水平，而铁死亡抑制剂 Fer-1 对 GPX4 的升高作用可被 cGAMP 阻断；Erastin 与 cGAMP 作用类似，STING 抑制剂 H-151 则能抑制 Erastin 诱导的 GPX4 降解（图 6a、b）。蛋白降解途径验证显示，仅溶酶体抑制剂（氯喹 CQ、NH4Cl）可有效阻断 cGAMP 诱导的 GPX4 降解并增加其丰度，自噬晚期抑制剂巴佛洛霉素 A1（Baf A-1）能阻断该降解，而自噬早期抑制剂（LY294002、3-MA、Wortmannin）及蛋白酶体抑制剂（MG-132、calpeptin）无此效果，表明 STING 通过促进自噬体与溶酶体融合介导 GPX4 的自噬降解（图 6c、d）。Sting 缺失可抑制 I/R 诱导的自噬（补充图 2g）；RFP-GFP-LC3 双荧光自噬示踪系统显示，A/R 条件下自噬激活，Sting-CKO 心肌祖细胞（MPCs）中黄色荧光点增多、红色荧光点减少，提示自噬体 - 溶酶体融合受阻、自噬体成熟障碍（图 6e–g）。三色免疫荧光分析显示，A/R 激活 STING 后，Stingfl/fl MPCs 中出现 LC3 斑点，且 STING、LC3 与 GPX4 存在明确共定位，Sting 缺失细胞中无此现象（图 6h）。STING-GPX4 复合物最初定位于内质网 - 高尔基体中间室（ERGIC），随后转运至 COP-I 囊泡及 LC3 标记的自噬体；A/R 诱导的 GPX4-STING 斑点可被溶酶体相关膜蛋白 2B（LAMP2B）标记的自溶酶体膜环绕，表明 STING 可招募 GPX4 进入自噬体，通过自噬 - 溶酶体途径降解（图 6i）。

图6 STING 通过自噬 - 溶酶体介导的 GPX4 降解促进铁死亡。（a）Fer-1 或 cGAMP 对 MPCs 中 GPX4 表达的 Western blot 检测及定量；（b）Erastin、cGAMP 或 H-151 诱导的 MPCs 中 GPX4 降解 Western blot 检测及定量；（c）cGAMP 诱导的 MPCs 中 GPX4 降解及 MG-132、NH4Cl、氯喹、钙蛋白酶抑制剂的阻断作用 Western blot 检测及定量；（d）cGAMP 诱导的 MPCs 中 GPX4 降解及 Baf A-1等的阻断作用 Western blot 检测及定量；（e–g）有无 A/R 处理的 Stingfl/fl 或 Sting-CKO MPCs 中 mRFP-GFP-LC3 标记的自噬流免疫荧光分析；（h）Stingfl/fl 或 Sting-CKO MPCs 中 GPX4、STING 与 LC3B 三重免疫荧光分析；（i）有无 A/R 处理的 MPCs 中 GPX4、STING 与 LAMP2B 三重免疫荧光分析

（7）AAV介导的GPX4过表达可缓解STING激活引起的心肌缺血再灌注损伤

携带心肌细胞特异性 cTNT 启动子且标记 GFP 的腺相关病毒（AAV-GPX4）用于体内实验，小鼠尾静脉注射该病毒 14 天后，术前 3 天腹腔注射 STING 激活剂 DMXAA 或 DMSO（图 7a），Western blot 与免疫荧光染色证实心肌细胞中 GPX4 过表达效率（图 7b）。DMXAA 可增大 I/R 后的心肌梗死面积，而 GPX4 过表达能显著缩小该面积（图 7c、d）；STING 激活会加剧 I/R 后的心脏功能障碍，GPX4 过表达则可明显改善心功能，表现为 I/R 后左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）升高（图 7e、f）。脂质过氧化标志物 4 - 羟基壬烯醛（4-HNE）水平因 STING 激活显著升高，GPX4 过表达可逆转该升高趋势，提示铁死亡被抑制（图 7g），心肌祖细胞（MPCs）中活性氧（ROS）积累检测结果与此一致（图 7h）。阻断 cGAS/STING 信号或过表达 GPX4，可部分恢复 A/R 条件下心肌细胞的 ATP 水平、线粒体膜电位（ΔΨm）、基础线粒体呼吸、ATP 生成量及最大和备用呼吸容量（补充图 4b–g），表明线粒体功能得到部分恢复。

图7 AAV 介导的 GPX4 治疗对 STING 激活引发的严重 I/R 损伤的心脏功能保护作用。（a）AAV 或 DMXAA 处理的 I/R 诱导心功能障碍时间线示意图；（b）心肌细胞中 GPX4 过表达验证的 Western blot；（c、d）心肌梗死面积；（e、f）超声心动图及 EF%、FS% 检测；（g）心脏边缘区切片 GPX4 与 4-HNE 双免疫荧光分析；（h）A/R 后 DMSO 或 DMXAA 处理下，AAV-cTNT-GPX4 或 AAV-Control 感染小鼠心肌细胞中 ROS 免疫荧光成像分析

（8）STING抑制剂H-151可减轻心肌缺血再灌注损伤

I/R 术前小鼠腹腔注射 STING 抑制剂 H-151（每两天一次，共 7 天）（图 8a i），体内心脏成像显示心肌坏死范围得到有效控制（图 8a ii）；H-151 处理可减少梗死面积（图 8b、c）、恢复心功能（图 8d、e），并缓解 I/R 诱导的 4 - 羟基壬烯醛（4-HNE）水平升高，提示脂质过氧化及铁死亡被抑制（图 8f）。体外实验中，H-151 可阻断 STING 与 GPX4 的相互作用（图 8g）、抑制自噬流（图 8h），进而减少活性氧（ROS）积累，减轻心肌铁死亡（图 8i）。

图8 STING 是缓解 I/R 后心功能障碍的潜在治疗靶点。（a）i. H-151 或 DMSO 处理的 I/R 诱导心功能障碍时间线示意图；ii. I/R 后 DMSO 或 H-151 处理小鼠的心脏代表性照片；（b、c）心肌梗死面积；（d、e）超声心动图及 EF%、FS% 检测；（f）心脏边缘区切片 GPX4 与 4-HNE 双免疫荧光分析；（g）A/R 后 DMSO 或 H-151 处理小鼠心肌细胞中 GPX4 与 STING 免疫荧光分析；（h）A/R 后 DMSO 或 H-151 处理小鼠心肌细胞中 mRFP-GFP-LC3 标记的自噬流免疫荧光分析；（i）A/R 后 DMSO 或 H-151 处理小鼠心肌细胞中 ROS 免疫荧光成像分析；（j）STING 促进 MI/R 损伤的机制示意图