为了解决上述问题，清华大学张洪杰院士、刘凯教授、万思康博士和中国科学院长春应用化学研究所刘雅薇副研究员、华东师范大学孙静研究员构建了一种时序性免疫调控水凝胶（TIH），旨在通过动态调控免疫-成骨微环境促进感染性骨缺损修复。该水凝胶由改性蛋白与氧化海藻酸钠通过席夫碱和光交联反应形成，模拟细胞外基质结构以支持细胞黏附与迁移，并掺入Zn/Ca磷酸盐纳米颗粒，实现Ca²⁺与Zn²⁺的时序释放。其中Ca²⁺通过TRPC1-STAT1/NF-κB通路诱导早期M1巨噬细胞活化，加速病原清除；Zn²⁺则通过STAT6/PPARγ通路促进M2极化，增强成骨分化。同时，水凝胶具有抗氧化和抗菌功能，进一步改善早期感染清除和骨再生起始。动物实验显示，该水凝胶在颅骨感染缺损模型中显著促进血管生成与成骨修复，验证了通过时序性免疫调控重塑骨愈合过程的可行性与临床潜力。该文章于2025年9月20日以《Temporal Immunomodulatory Hydrogel Regulating the Immune-Osteogenic Cascade for Infected Bone Defects Regeneration》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202514419）。

图1 TIH的设计和功能。TIH制备示意图。TIH通过按时间顺序释放Ca/Zn离子来调节免疫成骨微环境。此外，TIH还具有抗菌、抗氧化和血管生成特性，进一步促进感染性骨缺损中的成骨作用

（1）TIH的设计和制造

TIH通过光引发的双重交联策略构建，采用含赖氨酸重复序列和EGF结构域的重组蛋白KE作为主要成分，成功在大肠杆菌中合成并修饰为丙烯酸化蛋白。部分氧化的海藻酸钠（OSA）作为醛基来源，可与KE形成席夫碱反应。通过与OSA的共交联反应，形成类ECM双网络结构。为实现离子时序释放，合成并修饰ZIF-L纳米颗粒，进一步矿化生成ZPH，XPS证实了Ca和Zn的存在（Figures 2b），SEM显示其表面HA沉积并具有Ca/P≈1.7（Figures 2c）。KE-Acrylate、OSA与ZPH混合液在UV照射下3 min内成胶（Figures 2d），具有良好的可注射性。。水凝胶具有10–50 nm的多孔结构，EDS证实Ca、P、Zn均匀分布（Figure 2e）。流变学结果显示G′高于G″并随频率增加（Figure 2f）。离子释放实验显示Ca²⁺在24 h内快速释放（≈60 mg L^-1），Zn²⁺则在7天内逐步释放（Figure 2g，h），符合M1→M2巨噬细胞时序极化需求。

图2 TIH的制备与表征。a) TIH合成示意图。b) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH纳米粒子的高分辨率XPS光谱。c) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH纳米粒子的SEM图像。d) TIH的溶胶-凝胶转变，显示其可注射和快速凝胶化能力。e) TIH的SEM和相应的元素映射图像，证实了多孔结构以及Ca和Zn元素的存在。f) TIH的G′和G′′随频率的变化。g,h) 0.9％NaCl中TIH随时间的Ca²⁺（g）和Zn²⁺（h）的释放动力学

（2）TIH体外促进细胞增殖和血管生成

CCK-8检测显示KO和TIH提取液均显著提高BMSCs活力，TIH与KO相当（Figure 3a），活死染色结果一致。BMSCs在TIH上附着和增殖良好，呈铺展形态，且可在多孔结构中迁移（Figure 3b）。划痕实验显示KO和TIH均促进细胞迁移，闭合率分别为65%和79%（Figure 3c,d）。血管生成实验表明KO和TIH均显著促进HUVECs管腔形成，TIH形成的血管网络更为完整（Figure 3e,f）。ROS检测显示TIH显著降低细胞内ROS水平，使H₂O₂诱导的ROS接近生理水平（Figure 3g,h），DPPH实验进一步验证了其抗氧化能力。抗菌实验结果显示KO和TIH对MRSA和E. coli均具有抑菌作用，TIH在12 h内对两种菌株的抑制均超过90%。

图3 TIH 的体外细胞相容性、迁移、血管生成和抗氧化能力。a) 用 CCK-8 测量与不同材料共培养的 BMSCs 的细胞活力。b) 与 TIH 共培养的 BMSCs 的 3D 形态。粘着斑蛋白免疫荧光染色显示共培养 24 小时后，BMSCs 在 TIH 内粘附并存活良好。c) 划痕试验监测不同处理下 BMSCs 的迁移活性。d) 通过测量划痕愈合试验的面积定量分析不同处理下 BMSCs 的迁移活性。e) 管形成试验的代表性图像评估不同处理下 HUVECs 的血管生成潜力。f) 定量分析不同处理下网状和连接形成的状况。g) DCFH-DA 染色图像显示不同处理下细胞内氧化应激。在H2O2氧化环境中，经TIH处理后，DCFH-DA的荧光强度减弱，显示出其强大的抗氧化能力。h) 定量分析H2O2的细胞荧光强度。n = 5个独立实验。数据以平均值±SD表示。通过单因素方差分析和Tukey事后检验确定统计学意义。ns表示无显著差异，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

（3）通过TIH顺序释放离子进行免疫调节

划痕和增殖实验显示TIH显著促进巨噬细胞增殖与迁移。流式细胞术结果表明，巨噬细胞内Ca²⁺水平在第1天显著升高，随后逐渐下降，而Zn²⁺水平在5天内持续上升（Figures 4a–c），钙离子荧光结果进一步验证了这一时序释放特征。流式及共聚焦分析显示，TIH在第1天显著上调M1标志物CD86和iNOS，而M2标志物CD206水平较低；第3天CD206显著上升并伴随CD86下降，表明由M1向M2的表型转变（Figures 4d–f）。这一过程与Ca²⁺介导的早期M1极化及Zn²⁺诱导的后期M2极化相一致，表明TIH通过离子时序释放实现了M1→M2极化调控，从而在感染清除与组织再生之间建立动态平衡，加速骨修复。

图4 TIH 体外调控细胞内钙、锌振荡及巨噬细胞极化。a) FCM 测量干预 1 天和 3 天后巨噬细胞内 Ca ²⁺和Zn ²⁺荧光强度。b,c) 使用 FCM 测量定量分析 Ca 2+阳性 (b) 和 Zn 2+阳性 (c) 细胞的百分比。d) 免疫荧光染色图像显示 RAW264.7 巨噬细胞在与 TIH 共培养后从第 1 天的 M1 到第 3 天的 M2 的表型转变（蓝色：DAPI，绿色：CD206，红色：iNOS）。e) FCM 检测巨噬细胞表面 CD86 和 CD206 的表达。f) FCM 分析巨噬细胞表面 CD86 和 CD206 的表达。n = 5次独立实验。数据以平均值±SD 表示。通过单因素方差分析和 Tukey 事后检验确定统计学显著性。** p < 0.01，*** p < 0.001

（4）免疫-成骨级联的调节增强成骨分化

BMSCs与KO或TIH共培养均显著提高ALP活性，而与TIH及RAW264.7巨噬细胞共培养时表现出最高的ALP活性和最强的矿化能力（Figure 5a–c）。免疫荧光及定量分析显示，TIH+RAW264.7组显著增强RUNX2、BMP-2、OCN和VEGF的表达（Figure 5d–h）。RT-PCR结果进一步证实该组在上述基因水平上显著上调（Figure 5i），表明TIH通过巨噬细胞介导的免疫-成骨级联调控促进成骨与血管生成。

图5 免疫成骨级联调控对体外成骨分化的影响。a) 通过将 TIH 和 RAW 264.7 与 BMSCs 共培养来评估免疫成骨级联调节对成骨分化的影响的实验装置示意图。b,c) 不同处理下 BMSCs 的 ARS 染色 (b) 和 ALP 染色 (c)。d–g) 免疫荧光染色图像显示成骨分化标志物，包括不同处理下 BMSCs 中的 BMP-2 (d)、RUNX2 (e)、OCN (f) 和 VEGF (g)。h) 量化 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 的细胞荧光强度。i) RT-PCR 分析显示 BMSCs 中 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 的基因表达水平。n = 5 次独立实验。数据以平均值±SD表示。通过单因素方差分析和 Tukey 事后检验确定统计学显著性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。（4）体外成骨评价

（5）使用TIH进行感染性骨缺损的体内再生

在感染性颅骨缺损大鼠模型中评价了TIH的骨再生能力（Figure 6a）。三维micro-CT结果显示，TIH组在缺损边缘及中央均表现出明显的新骨形成，优于KO组和对照组（Figure 6b）。定量分析表明，TIH组的BV/TV、BMD和Tb.N均显著高于其他组（Figure 6c–e）。在抗菌性能方面，TIH组缺损部位肉芽组织中细菌负荷在7天后明显低于对照组（Figure S27）。H&E染色显示TIH组新骨形成量和骨连续性均优于KO组和对照组（Figure 6f），MT染色进一步证实TIH组缺损部位胶原沉积更丰富，显示其更强的成骨分化能力（Figure 6g）。

图6 TIH促进体内感染性骨缺损再生。a) 动物实验设计示意图。b) 术后8周颅骨的3D Micro-CT重建图像。c–e) BV/TV、BMD和Tb. N的定量分析，反映不同治疗下的骨修复和再生效果。f,g) 术后8周颅骨的H&E (f)和MT (g)染色图像。缺损区域用箭头指示。底部图像对应于框中区域的放大视图。NB：新骨，F：纤维组织，V：血管。n = 5个独立实验。数据以平均值±SD表示。通过单因素方差分析和Tukey事后检验确定统计学显着性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

免疫组化染色及定量分析显示，TIH组BMP-2、RUNX2、OCN及VEGF的表达水平均显著高于其他组（Figure 7a）。免疫荧光分析结果表明，TIH处理后CD86表达下调，而CD206表达显著上调（Figure 7b；Figure S28）。主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）组织学分析未见明显炎性细胞浸润、坏死或其他病理异常（Figure S29）。

图7 TIH 治疗感染性颅骨缺损后体内成骨、血管生成和免疫调节表现。a) 不同处理下术后颅骨中 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 蛋白的免疫组织化学染色图像及相应的定量分析。b) 不同处理下术后颅骨中 CD86 和 CD206 表达的免疫荧光染色图像及相应的定量分析，揭示体内巨噬细胞的极化。n = 5 个独立实验。数据以平均值±SD 表示。通过单因素方差分析和 Tukey 事后检验确定统计学显着性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001