针对上述问题，武汉大学中南医院李志强教授团队研究开发了一种基于近红外二区（NIR-II）有机分子MYM的光疗平台，将MYM封装于293F细胞衍生的外泌体并用iRGD肽功能化形成MYM@iRGD-Exo。体内研究发现MYM@iRGD-Exo能有效穿透血脑屏障靶向GBM细胞，激光照射下可显著抑制肿瘤发展，促进T细胞浸润增强免疫反应，RNA测序分析揭示了免疫反应通路的激活，为GBM治疗提供了一种整合精准靶向递送、多模态成像及协同治疗效果的有效方法，有望克服现有治疗局限并改善癌症临床结局。该文章于2025年6月20日以《NIR-II Engineered Exosome Nanotheranostic Probes for“Oriented Blasting”in Orthotopic Glioblastoma》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c01541）。

图1.MYM@iRGD-Exo构建的示意图

（1）MYM@iRGD-Exo的表征

通过B3LYP/6–31G(d)基组进行Gaussian DFT计算，确定了DT的HOMO和LUMO轨道表面（图1 A）。¹H NMR 和 ¹³C NMR和MALDI-TOF-MS验证了所有中间体和MYM的结构。MYM在约720 nm处有最大吸收（图1 B），910 nm附近有最大发射波长（图1 C），808 nm激发下荧光发射光谱延伸至1100 nm。293F细胞分离的细胞外囊泡直径约100 nm，呈碟状，挤压负载MYM后形态变化不显著（图1 D、图1 E）。外泌体、MYM和MYM@iRGD-Exo的流体动力学直径分别为106.65±2.00 nm、1114.39±133.18 nm和116.85±7.88 nm（图1 F），zeta电位值分别为–38.90±1.19 mV、4.70±0.25 mV和–26.77±3.60 mV（图1 G）。MYM@iRGD-Exo紫外/可见吸收光谱在720 nm处显示特征峰（图1 H、图1 I）。4°C PBS中储存3天后，MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的尺寸和zeta电位无显著变化（图1 J、图1 K）。荧光探针和电子自旋共振光谱法检测发现，MYM@iRGD-Exo在激光照射下主要产生•OH和O2•–，¹O₂产生量极少（图1 L-1 N），DMPO和BMPO加合物产生强烈ESR信号（图1 O）。MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下有明显温度升高，且与材料浓度正相关（图1 P、图1 Q），光热转换效率达34.5%（图1 R）。

图2.MYM@iRGD-Exo的特性表征。（a）MYM的HOMO、LUMO和偶极矩计算结果（DFT B3LYP/6-31G(d)方法）；（b）MYM的吸收光谱；（c）MYM的荧光发射光谱；（d）囊泡的透射电镜图像；（e）MYM@iRGD-Exo的透射电镜图像；（f）囊泡和MYM@iRGD-Exo的流体动力学直径；（g）囊泡、MYM和MYM@iRGD-Exo的zeta电位测量；（h）MYM、囊泡和MYM@iRGD-Exo的紫外/可见光谱；（i）MYM（DMSO中）、囊泡（PBS中）和MYM@iRGD-Exo（PBS中）的颜色外观；（j）MYM@iRGD-Exo在PBS中悬浮1、2、3天的zeta电位变化；（k）MYM@iRGD-Exo在PBS中悬浮1、2、3天的流体动力学直径变化；（l）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下产生的1O2；（m）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下产生的•OH；（n）MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下产生的O2•–；（o）ESR光谱显示MYM@iRGD-Exo产生的1O2、•OH和O2•–；（p）MYM@iRGD-Exo样品（MYM，100μg/mL）在激光照射下的光热加热图像；（q）不同浓度下MYM@iRGD-Exo在808 nm激光照射下的光热加热行为；（r）MYM@iRGD-Exo的光热转换效率

（2）体外PDT/PTT协同效应和生物相容性

实验评估了MYM和MYM@iRGD-Exo的肿瘤治疗诊断潜力。GBM U251细胞孵育2小时后呈现红色荧光，与MitoTracker Green共染色显示两种化合物定位于线粒体（图2A、2B）。CCK-8法显示二者在暗光下无显著毒性，激光照射下细胞活力下降，1000 nM时细胞死亡超90%（图2C、2D）。DCFH-DA显示仅MYM+L组和MYM@iRGD-Exo+L组产生显著ROS（图2E）。Calcein-AM/PI染色显示此两组几乎全部细胞死亡，证实光疗协同作用。JC-1染色显示治疗后线粒体膜电位降低。流式细胞术分析显示MYM+激光组癌细胞凋亡率50.41%、坏死率16.7%，MYM@iRGD-Exo+激光组凋亡率54.79%、坏死率17.3%，对照组极少凋亡或坏死（图2F）。

图3.MYM和MYM@iRGD-Exo在U251细胞中的特性。（a）MitoTracker Green（绿色）与MYM（红色）在U251细胞中的共定位；（b）MitoTracker Green（绿色）与MYM@iRGD-Exo（红色）在U251细胞中的共定位；（c）不同浓度的MYM对U251细胞相对活力的影响，包括暴露于808 nm激光照射（0.33 W/cm²）和不暴露的情况（n=3）；（d）不同浓度的MYM@iRGD-Exo对U251细胞相对活力的影响，包括暴露于808 nm激光照射（0.33 W/cm²）和不暴露的情况（n=3）；（e）不同处理后U251细胞内的ROS生成、活/死细胞染色和JC-1染色；（f）通过FACS评估不同配方处理的U251细胞凋亡分析

（3）体外血脑屏障穿透与胶质母细胞瘤靶向

实验表明，iRGD肽因对肿瘤内皮细胞上整合素的强亲和力，可有效增强载体对肿瘤的穿透性。整合素（图3B、3C）和NRP1/2在GBM组织中高表达，使iRGD对肿瘤部位的靶向性和可及性增强。体外BBB模型实验中，当电阻超250Ω时，BBB模型形成，共培养4小时后，MYM@iRGD-Exo的体外BBB穿透效率约25%，而单独MYM或MYM@Exo无法穿过（图3E）。将GL261细胞接种在BBB模型底部，共聚焦显微镜分析显示GL261细胞中强烈红色荧光，证实MYM@iRGD-Exo对GBM细胞靶向有效（图3F、3G）。综上，MYM@iRGD-Exo具备显著的BBB穿透和GBM细胞靶向能力。

图4.MYM@iRGD-Exo的BBB穿透效率和GBM靶向性。（a）通过HPEPDock软件分析的iRGD与整合素的结合，展示了整合素αvβ3与iRGD复合物；（b）GBM组织中ITGAV的相对表达水平；（c）GBM组织中ITGB3的相对表达水平；（d）用于评估MYM@iRGD-Exo体外BBB穿透效率的实验模型示意图；（e）MYM、MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的BBB穿透效率测量结果（n=3）；（f）共聚焦显微镜图像显示皿底部的GL261细胞，追踪MYM细胞摄取的时间进程（n=3）；（g）共聚焦显微镜图像显示皿底部的GL261细胞，追踪MYM@iRGD-Exo细胞摄取的时间进程（n=3）

（4）体内荧光成像和光热成像

研究显示，MYM@iRGD-Exo在胶质母细胞瘤原位小鼠模型中具有良好的NIR-II成像和光热成像效果。尾静脉注射后，其信号在胶质母细胞瘤中6小时可检测到，24小时达峰值后渐弱（图4A）。离体脑组织荧光成像确认了该结果（图4B）。在主要器官组织的离体NIR-II荧光成像也进行了观察。注射后24小时，用808 nm激光照射肿瘤区5分钟，温度迅速升至近50°C，显示了其有效的光热效应（图4C、4D）。

图5.MYM@iRGD-Exo的荧光成像和光热成像。（a）GBM小鼠中MYM@Exo和MYM@iRGD-Exo的实时NIR-II成像；（b）小鼠脑组织的离体NIR-II荧光成像；（c）GBM小鼠在不同时间点的红外热成像；（d）激光照射5分钟（808 nm，1.0 W/cm²）期间的温度变化

（5）体内光动力治疗与光热治疗协同疗法

在C57BL/6J小鼠原位胶质母细胞瘤模型中验证了MYM@iRGD-Exo的抗癌活性（图5A）。将带瘤小鼠随机分为PBS组、PBS+激光组、MYM@iRGD-Exo组、MYM@iRGD-Exo+激光组。注射后24小时，以1.0 W/cm²的功率用808 nm激光照射脑肿瘤5分钟，每4天监测一次肿瘤生长。结果显示，MYM@iRGD-Exo+激光组的肿瘤抑制效果显著（图5B、5C），该组小鼠生存时间超过50天，而对照组约为35天（图5D）。H&E染色显示该组肿瘤细胞出现空泡化和核固缩现象（图5E）。Ki67和TUNEL染色表明，经808 nm激光照射的MYM@iRGD-Exo可使肿瘤细胞增殖减少、凋亡增加（图5F）。

图6 NIR-II图像引导的MYM@iRGD-Exo光动力治疗/光热治疗。（A）治疗MYM@iRGD-Exo实验设计示意图；（B，C）生物发光成像监测GBM异种移植生长（n=3）；（D）不同治疗组GBM小鼠生存曲线（n=7）；（E）H&E染色证实脑切片中肿瘤存在；（F）Ki67和TUNEL染色评估肿瘤细胞增殖和凋亡

（6）体内激活抗肿瘤免疫

RNA测序表明，MYM@iRGD-Exo+L组与对照组相比有353个差异表达基因（DEGs），其中215个上调，138个下调（图6A，S19）。KEGG通路富集分析显示治疗影响多个癌症相关通路（图6B）。GO分析显示DEGs在多个生物学过程、细胞组分和分子功能中显著富集。GSEA显示治疗显著激活细胞凋亡（图6C），涉及线粒体蛋白复合物（图6D），并富集免疫相关过程（图6E）。mMCP-counter显示治疗组T细胞浸润增加（图6F）。GSEA还表明TNF-α信号和IFN-γ反应显著激活（图6G，6H）。蛋白 - 蛋白相互作用网络揭示了关键基因，治疗组CD4+和CD8+T细胞浸润显著（图6I）。这些结果表明治疗后治疗部位发生T细胞募集和激活。

图7 MYM@iRGD-Exo激活抗肿瘤免疫。（A）显示353个差异表达基因（DEGs）的火山图，显著上调基因红色表示，下调基因蓝色表示；（B）Circos图可视化与DEGs相关的富集KEGG通路；（C）基因集富集分析（GSEA）显示在MYM@iRGD-Exo处理的肿瘤组织中凋亡上调；（D）线粒体蛋白复合物下调；（E）山脉图显示GSEA识别的生物学过程；（F）比较对照组和治疗组的浸润免疫细胞丰度；（G）GSEA表明在治疗组中TNF-α信号通过NF - kB通路上调；（H）INF - γ反应通路上调；（I）免疫荧光染色显示CD4+T细胞和CD8+T细胞在GBM肿瘤组织中的浸润

（7）体内生物安全性

通过检测血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）和尿酸（UA）等生化指标，评估了MYM@iRGD-Exo的生物安全性和生物相容性。结果表明，MYM@iRGD-Exo具有良好的生物安全性和生物相容性。