针对上述问题，广西医科大学陈文霞、王亚玲和蒋兴禄团队研发了一种载双抗生素的抗菌金纳米簇（Au NCs）水凝胶（DA@Au NCs），用于再生性牙髓治疗。该水凝胶通过静电相互作用和二硫键生成负载药物，在感染根管间质液作用下可膨胀填满根管，与细菌充分接触，并能被间质液和内部蛋白酶触发降解释放DA，其交联时间可调节降解时间。Au NC水凝胶具有放射线显影能力，可追踪药物位置和释放动态，提高抗菌效率，实现长期抗菌效果并降低细胞毒性，还能杀灭浮游细菌和生物膜，渗透至牙本质小管。同时，Au NCs的引入有助于支持干细胞的增殖、迁移、黏附和矿化，促进牙髓组织再生。该文章于 2024 年 10 月 9 日以《Visual Antimicrobial Gold Nanocluster Hydrogel with Inflammation-Responsive and Time-Regulated Swelling/Degradation for Regenerative Endodontic Procedures》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c14202）。

图1. DA@Au NC水凝胶的构建和多功能示意图

（1）合成与表征 DA@Au NC 水凝胶

通过生物矿化方法，以牛血清白蛋白（BSA）为模板和还原剂，与氯金酸（HAuCl₄）在碱性条件下反应合成金纳米簇（Au NCs），溶液颜色从浅黄色变为深棕色，紫外光下荧光呈深红色。图 2A 显示 Au NCs 为 2 ± 0.668 nm 的球形颗粒，图 2B 显示其紫外吸收光谱在 275 nm 处有吸收峰。超小 Au NCs 可渗透至牙本质小管，深度约 45 μm（图 2C）。将水加入 Au NCs 和 DA 的混合物中，通过静电相互作用和二硫键生成制备 DA@Au NC 水凝胶，Au NCs 与水比例小于 1:6 时呈凝胶状，DA 不影响水触发的 Au NC 水凝胶形成（图 2D）。XPS 结果显示 Au NC 水凝胶中二硫键比例高于 Au NC 溶液（图 2E、图 2F），且在二硫苏糖醇（DTT）溶液中可转变为液体（图 2G）。SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色结果表明 DA 能与 Au NCs 表层的 BSA 结合（图 2I）。SEM 图像显示 DA@Au NC 水凝胶孔径为 7.92 μm（图 2J），Au NCs 孔径为 15.23 μm，DA 与 Au NCs 间相互作用影响水凝胶结构。Au NCs 和 DA@Au NCs 的 X 射线强度与 Au NC 浓度呈正相关（图 2H），可作为根管内药物定位及释放动态监测的有效示踪材料。

图2 DA@Au NC水凝胶的合成与表征。（A）Au NCs的TEM图像；（B）Au NCs的紫外吸收光谱；（C）Au NCs在牙本质小管中的穿透深度（CLSM）；（D）Au NCs和DA@Au NCs水凝胶的外观图像；（E）XPS显示水凝胶中二硫键的增加；（F）溶液中二硫键的XPS谱图；（G）水凝胶在DTT溶液中溶解为溶液（红色箭头指向水凝胶）；（H）不同Au NCs浓度下的DA@Au NCs的CT图像及X射线放射强度随Au NCs浓度变化的函数；（I）SDS-PAGE显示BSA与DA结合的条带位置；（J）水凝胶的SEM图像显示多孔形态；（K）DA@Au NC水凝胶合成机制及凝胶化机理示意图

（2）与根管感染控制相关的水凝胶性能

构建的载双抗生素的金纳米簇水凝胶（DA@Au NC hydrogel）可有效控制根管感染。水凝胶能膨胀填充根管，包括根管峡部，延长抗菌剂有效半衰期，且可通过可视化手段监测药物浓度变化。其大孔结构基于 Flory−Rencher 理论，为高膨胀率提供基础，对药物有效递送至根管壁至关重要。细菌感染引起的组织液增加可作为膨胀剂，使水凝胶膨胀吸收炎症渗出液，填充整个根管腔（图 3A）。这种膨胀特性有助于控制出血，创造支持性微环境吸收细胞和因子，确保药物与根管壁上微生物充分接触，提高杀菌效率。DA@Au NC 水凝胶的交联时间与降解时间呈正相关，交联 30 分钟的水凝胶 10 天内完全降解，交联 24 小时的水凝胶 50 天后可降解（图 3B），据此建立的交联时间与降解时间的数学模型方程为 y = 51.13−45*e(−x/9.5)，拟合指数为 0.99987，可用于精确计算水凝胶的交联时间以适应不同治疗需求。水和酶均能触发水凝胶降解，且酶催化下降解速率显著提高，归因于水凝胶外壳中蛋白质与酶的特异性酶−底物磷酸化反应（图 3D）。DA@Au NC 水凝胶的间质液 / 酶双响应特性可根据炎症程度精确控制药物释放，实现高效、精准的根管内感染控制。动物实验证实了 DA@Au NC 水凝胶在体内的 X 射线追踪性能，为根管内药物的定位和释放动态监测提供有效手段（图 3E），且 DA@Au NC 水凝胶不会导致冠部染色，克服了传统三联抗生素中盐酸米诺环素引起的冠部变色问题（图 3I）。

图3 DA@Au NC水凝胶的控释特性。（A）DA@Au NC水凝胶的溶胀性能；（B）CLSM和立体显微镜显示水凝胶溶解后填充根管；（C）不同交联时间水凝胶的溶胀曲线显示交联时间越长，完全降解所需时间越长；（D）SEM显示交联24小时的水凝胶比交联30分钟的水凝胶更致密、孔隙更少；（E）XPS显示交联时间增加二硫键含量增加；（F）酶能加速水凝胶降解；（G）不同交联时间水凝胶在体内的降解过程；（H）CT图像显示根管内水凝胶的放射强度和体积变化；（I）功能关系显示放射强度、体积与剩余药物量之间的关系；（J）7天后水凝胶未引起牙本质染色

（3）DA@Au NC 水凝胶的抗菌活性

DA@Au NC水凝胶对根管感染相关细菌（包括屎肠球菌和牙龈卟啉单胞菌）的抗菌活性进行了评估，其对这两种细菌的最小抑制浓度均为4μg/mL，与DA的MIC相同，表明Au NCs的加入不影响DA的抗菌活性。含环丙沙星的水凝胶能几乎完全杀死屎肠球菌，而Au NCs和甲硝唑能显著消除大量牙龈卟啉单胞菌。抑制圈实验显示DA@Au NCs的抗菌效果可持续7天（图4A），第3天抑制圈减小是因为环丙沙星释放速率降低。SEM和TEM观察发现，经Au NCs处理的牙龈卟啉单胞菌细胞壁完整性遭到破坏，出现细菌收缩、碎片化和细胞壁降解等现象（图4B、C），而屎肠球菌未发现结构损伤。此外，DA@Au NC水凝胶在屎肠球菌生物膜中杀死了85%的细菌，在牙龈卟啉单胞菌生物膜中杀死了87%至92%的细菌（图4D），显示出与DA相当的抗菌活性，并且DA能从Au NC水凝胶中充分释放以杀死细菌。最后，DA@Au NC水凝胶在感染牙本质小管模型中对屎肠球菌和牙龈卟啉单胞菌的杀菌率均达79%（图4E），表明其能有效穿透牙本质小管杀死细菌，并展现出优异的生物膜抗菌活性。

图4 DA@Au NC水凝胶对E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性。（A）不同药物处理后不同时间点的抑制圈图像；（B）经Au NCs处理的P. gingivalis的形态变化和结构损伤的SEM观察；（C）经Au NCs处理的P. gingivalis的TEM观察（红色框放大为白色框）；（D）3D生物膜模型和受感染牙本质样本重建，并通过CLSM分析SYTO9/PI活/死荧光染色图像；（E）DA@Au NC水凝胶对E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性评估

（4）DA@Au NC 水凝胶的生物相容性及对 DPSC 功能的影响

Au NC水凝胶显著促进牙髓干细胞（DPSCs）矿化活性。DPSCs在Au NCs诱导下，成骨相关基因（如VEGF和ALPL）表达较高。RNA测序分析显示，Au NCs矿化能力主要通过调控细胞趋化、生长因子活性、血管生成和钙离子转运等生物过程实现。免疫荧光染色显示Au NC组中碱性磷酸酶（ALP）表达最高（图6E）。ALP染色表明，1250μg/mL浓度下Au NCs矿化能力最显著（图6F）。RT-PCR结果显示，Au NCs中矿化相关基因（Runx-2、ALP、COL-I）的mRNA表达量高于对照组（图6G）。细胞wound scratch实验显示，Au NCs和DA@Au NCs的迁移率分别为22%和17%，显著高于DA组的2%（图5C）。Au NC水凝胶处理的牙本质切片上，DPSCs显示出良好细胞伸展特性和微丝连接，而DA处理组细胞数量显著减少（图5B）。这些结果表明，Au NC水凝胶通过调控ALP表达和相关基因表达，显著提高DPSCs矿化能力，为细胞迁移和黏附提供有利微环境，促进牙髓组织再生。

图5 DA@Au NC水凝胶对DPSCs的生物相容性和功能影响。（A）经每种药物处理的DPSCs的活/死染色；（B）DPSCs在经不同处理的牙本质上的黏附和伸展的CLSM图像（蓝色为细胞核，红色为细胞骨架）；（C）不同组处理后DPSCs迁移的代表性图像及迁移率；（D）用ALP和ARS染色评估DPSCs矿化能力

图6 DPSCs在Au NCs培养下的RNA测序分析。（A）火山图显示Au NCs与P-Control组间差异表达基因；（B）GO条款和KEGG通路从差异表达基因中富集；（C）差异表达基因的KEGG通路富集分析；（D）代表性差异基因的热图；（E）各组ALP表达的免疫荧光染色；（F）不同浓度Au NCs的ALP染色；（G）通过RT-PCR检测与矿化相关的基因表达

（5）体内实验：DA@Au NC 水凝胶的生物相容性与抗菌效果评估

在犬类根尖周病变模型中，DA@Au NC水凝胶展现出优异的X射线追踪性能，可通过放射强度变化监测药物释放（图7B）。经过4周治疗，DA@Au NC水凝胶显著减少了根管内的细菌数量（图7C），并通过CBCT三维重建显示其促进了根尖周炎症病变的愈合，疗效优于其他组（图7D和表S2）。此外，DA@Au NC水凝胶降低了炎症相关基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达（图8A），并通过组织学检查显示其促进了根尖周围组织的修复和新骨形成（图8B）。免疫荧光染色进一步证实了其降低IL-6表达并提高ALP表达的能力（图8C）。这些结果表明，DA@Au NC水凝胶具有出色的愈合和修复能力。

图7 DA@Au NC水凝胶的体内生物相容性和抗菌效果评估。（A）根尖周病变模型的建立和根管消毒程序；（B）给药前后X射线图像显示DA@Au NCs水凝胶的放射强度和体积变化；（C）放置根管药物前后根管内细菌菌落计数；（D）CBCT扫描的3D重建显示根尖周病变在放置根管药物前后的变化

图8 DA@Au NC水凝胶对根尖周病变愈合的影响。（A）通过RT-PCR检测炎症相关基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达，DA@Au NC组表达量显著降低；（B）H&E染色和马松三色染色显示DA@Au NC处理后根尖周组织破坏面积减小，该组在根尖区周围有大量致密纤维组织和少量新骨形成；（C）免疫荧光染色显示DA@Au NC组IL-6表达较低，ALP表达较高