研究背景：

针对上述问题，北京大学第三医院韩洪斌团队基于由聚合物PC6AB与磷酸锰离子聚合物（MnP）组成的有机-无机共聚物，开发了一种肿瘤微环境（TME）响应性纳米激动剂。纳米激动剂在酸性TME中的降解使其能够分别向肿瘤细胞和免疫细胞进行时空控制递送。具有膜溶解活性的PC6AB选择性地与肿瘤细胞膜相互作用以诱导免疫原性细胞死亡，而锰金属可以激活免疫细胞中的STING通路并触发下游免疫刺激信号。纳米激动剂在脑细胞外空间（ECS）局部注射后可以刺激强大的抗肿瘤免疫，在鼠胶质瘤中显示出显著的治疗效果。纳米激动剂能够响应TME并实现STING激活的时空协调，增强对“冷”实体瘤的免疫反应，为临床免疫治疗提供了一种有前景的方法。该文章于2025年4月29日以《Smart Organic–Inorganic Copolymer Nanoparticles Distinguish Between Microglia and Cancer Cells for Synergistic Immunotherapy in Glioma》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202500882）。

研究示意图

（1）纳米配体的构建与表征

MnP通过将锰离子和磷酸溶解在乙醇中，使用三甲胺（TEA）作为端帽剂制备，形成离子寡聚物而非磷酸锰结晶（图1a）。MnP的电喷雾电离质谱（ESI-MS）显示其以聚合状态存在（图1c）。粉末X射线衍射（XRD）表明MnP为非晶态（图1d）。MnP可与有机聚合物共聚形成复合材料，提高负载效率和稳定性，减少毒性。

PC6AB聚合物由聚（环氧乙烷）（PEO）片段和含有C6A、Bn和氨基乙基（AMA）甲基丙烯酸酯单体合成，其氨基可通过氢键与MnP偶联（图S5）。PC6AB-MnP的杂化通过将MnP加入PC6AB溶液中实现（图1e）。凝胶渗透色谱法（GPC）测得PC6AB-MnP的重量平均分子量为25.1 kDa。ATR-FTIR显示PC6AB与MnP间形成氢键（图1f）。拉曼光谱进一步确认了这种氢键介导的相互作用（图1g）。粉末XRD和差示扫描量热法（DSC）分析表明形成了新的配位复合物（图1h、图1i）。扫描电子显微镜（SEM）显示了无机寡聚物和有机聚合物的融合（图1j）。

通过自组装制备两种纳米颗粒：NP（纯PC6AB聚合物）和NP-MnP（与MnP偶联的PC6AB聚合物）。ICP-OES测得NP-MnP中MnP的包封效率为86.1%（图1k）。元素映射证实了NP-MnP中存在锰、氮和氧元素（图1l）。透射电子显微镜（TEM）显示NP-MnP和NP在pH 7.4时具有球形形态。纳米颗粒在低pH下降解导致荧光发射显著增加，不同pH下溶液的近红外一区（NIRI）显示出明显的荧光转变（图1m）。MnP作为T1加权MRI的造影剂，最佳成像浓度约为0.25–1.00 mm（图1n）。图1o显示MnP-NP的MRI具有pH依赖性，随着pH值降低，信号强度增加。体外MRI和NIRI研究证实了纳米颗粒的酸响应特性，MnP-NP可用作酸增强荧光/磁性成像探针。

图1 NP-MnP的表征。（a）MnP寡聚物封端策略及反应条件示意图；（b）MnP的TEM图像，展示形态细节；（c）MnP的质量光谱；（d）MnP和Mn₃(PO₄)₂的XRD图谱；（e）PC6AB-MnP杂化分子结构示意图；（f）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的ATR-FTIR光谱；（g）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的拉曼光谱；（h）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的XRD图谱；（i）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的DSC图谱；（j）MnP、PC6AB和PC6AB-MnP的SEM图像，红色圆圈标示聚集的MnP；（k）MnP、NP和MnP-NP的zeta电位，数据为平均值±标准差（n=3）；（l）NP-MnP的元素分布图；（m）NP-MnP在pH 6.4、6.8、7.0、7.2和7.4时的近红外光谱；（n）MnP在不同浓度下的T1加权MRI；（o）NP-MnP在pH 6.4、6.8、7.0、7.2和7.4下的T1加权MRI

（2）pH依赖性纳米激动剂的膜溶解选择性

PC6AB可在酸性肿瘤微环境中选择性破坏质膜，在正常组织中毒性小。在生理pH环境中，PC6AB自组装成中性纳米颗粒，膜裂解模块被屏蔽，膜溶解活性小（“OFF”状态）。在酸性肿瘤微环境中，NP-MnP通过质子化激活膜裂解模块，与肿瘤细胞膜上的磷脂酰丝氨酸结合，实现对肿瘤细胞和免疫细胞的特异性识别。实验表明，在pH 7.4时，NP-MnP对GL261细胞和BV2细胞毒性小（图2a,b）。在pH 6.8时，NP-MnP对GL261细胞毒性显著高于BV2细胞，表现出剂量和时间依赖性（图2c,d）。SEM和TEM结果显示，在pH 6.8时，NP-MnP使GL261细胞膜出现孔洞和细胞内容物释放，而BV2细胞膜无明显变化（图2e,f）。CLSM观察到，在pH 6.8时，NP-MnP-Cy5使GL261细胞肿胀、膜完整性受损，而BV2细胞形态和膜完整性不受影响（图2g,h）。脂质体实验表明，在pH 6.8时，模拟肿瘤细胞膜的脂质体与NP-MnP孵育后荧光斑点显著减少，表明膜破裂和染料泄漏，而模拟正常细胞膜的脂质体无明显变化（图2i-k）。这些结果证实了NP-MnP对肿瘤细胞膜的靶向破坏和膜溶解选择性。

图2 NP-MnP的pH依赖性膜溶解选择性。（a）NP-MnP对GL261细胞和BV2细胞在pH 7.4下孵育1小时后的浓度依赖性细胞毒性；（b）NP-MnP对GL261细胞和BV2细胞在pH 7.4、浓度为25µg mL⁻¹下的时间依赖性细胞毒性；（c）NP-MnP对GL261细胞和BV2细胞在pH 6.8下孵育1小时后的浓度依赖性细胞毒性；（d）NP-MnP对GL261细胞和BV2细胞在pH 6.8、浓度为25µg mL⁻¹下的时间依赖性细胞毒性；（e）GL261细胞和BV2细胞在pH 7.4或6.8、用NP-MnP（50µg mL⁻¹）处理1小时后的SEM图像；（f）GL261细胞和BV2细胞在pH 7.4或6.8、用NP-MnP（50µg mL⁻¹）处理1小时后的TEM图像；（g）GL261细胞在pH 6.8、用NP-MnP-Cy5（50µg mL⁻¹）在不同时间点（0和1小时）处理后的图像；（h）BV2细胞在pH 6.8、用NP-MnP-Cy5（50µg mL⁻¹）在不同时间点（0和1小时）处理后的图像；（i）用于模拟不同细胞膜的脂质体模型示意图，NP-MnP的膜溶解活性通过观察脂质体在添加NP-MnP前后的荧光变化来评估；（j）在pH 7.4或6.8条件下添加NP-MnP后，正常细胞和肿瘤细胞膜模拟脂质体的图像；（k）确定每个视野的斑点计数并用于统计分析（n=3个视野）

（3）体外激活STING通路

免疫疗法改变了癌症治疗，但胶质母细胞瘤因免疫功能受损而高度免疫抑制。由锰和STING激动剂组成的纳米激动剂可提高胶质瘤抗肿瘤疗效，解决STING激动剂的降解和脱靶毒性问题。锰是cGAS-STING途径的激活剂。实验表明，MnP比MnCl₂更能上调P-TBK1、P-IRF3和P-STING的表达水平，且STING表达下降表明其磷酸化（图3a）。免疫荧光观察到MnP比MnCl₂更强地激活STING途径（图3b）。细胞毒性实验显示MnP在有效浓度范围内对GL261细胞和BV2细胞无明显毒性（图3c）。全基因组RNA测序分析显示，MnP处理的细胞与对照组相比有492个差异表达基因，其中229个上调，263个下调（图3d）。热图显示MnP处理的细胞中Ifnb1、Isg15和Cxcl10等基因上调（图3e），表明MnP通过诱导干扰素产生刺激免疫激活。

图3.MnP激活了cGAS-STING通路，并在体外促进了纳米激动剂的细胞内摄取。（a）经MnCl₂或MnP处理后，STING通路相关蛋白表达水平的浓度依赖性变化，通过蛋白质印迹分析确定；（b）治疗后P-STING表达的CLSM图像；（c）MnP对GL261细胞和BV2细胞的浓度依赖性细胞毒性，数据表示为均值±标准差（n=3），统计分析采用双因素方差分析，P值大于0.05表示无显著差异；（d）火山图显示PBS处理组和MnP处理组之间的差异表达基因；（e）PBS和MnP处理细胞的基因表达热图；（f）在pH 7.4条件下，NP-MnP或NP+MnP在孵育1小时后的浓度依赖性细胞毒性（NP-MnP：由共聚化的PC6AB-MnP自组装形成的纳米颗粒，NP+MnP：由PC6AB自组装形成的纳米颗粒，添加等量的MnP）；（g）NP-MnP-Cy5在BV2细胞中浓度依赖性摄取的代表性流式细胞术图谱；（h）NP-MnP-Cy5在BV2细胞中浓度依赖性摄取的半定量；（i）BV2细胞与NP-MnP-Cy5孵育的代表性CLSM图像；（j）通过ICP-MS测量了用NP-MnP（10、25和50µg mL⁻¹）处理的GL261和BV2细胞内的锰（Mn）摄取量

Mn²⁺可在磷酸盐溶液中刺激免疫反应，但在生理盐水中无效，且易聚集沉淀失去佐剂活性。为解决此问题，用Mn²⁺、磷酸盐和TEA合成了MnP，TEA的加入稳定了磷酸锰，增强了其激活STING通路的有效性，且MnP的纳米颗粒结构提高了细胞摄取效率，与MnCl₂相比，STING通路激活更有效。实验显示，添加MnP的纳米颗粒细胞毒性更高（图3f），而MnP与有机聚合物聚合形成的纳米颗粒在生理环境下包封在疏水核中，表现出低毒性。

纳米激动剂在BV2小胶质细胞上的细胞内递送和免疫刺激作用研究表明，BV2细胞对NP-MnP-Cy5的摄取呈浓度依赖性（图3g,h）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）监测到显著的细胞内内化（图3i）。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测量结果显示，BV2细胞比GL261细胞吸收了更多的锰，且随时间趋势更明显（图3j）。分析认为，BV2细胞中锰含量较高是PC6AB治疗诱导肿瘤细胞死亡的结果，而非MnP对免疫细胞的固有特异性。肿瘤细胞死亡后，免疫细胞被招募到肿瘤部位摄取MnP以增强免疫激活，且肿瘤细胞对MnP的摄取也可触发免疫激活反应，P-STING蛋白水平上调表明MnP激活了肿瘤细胞中的STING通路。

开环-无机共聚反应制备的含有锰和STING激动剂ADU-S100的纳米颗粒（NP-MnP-ADU）与免疫细胞中的cGAS形成复合物，产生强烈的抗癌免疫反应（图4a）。免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜观察到与NP-MnP-ADU共培养的细胞中P-TBK1、P-IRF3和P-STING的上调表达（图4b）。Western blot数据显示，NP-MnP-ADU处理的BV2细胞中cGAS-STING通路的主要成分表达水平上调（图4c）。NP-MnP-ADU在肿瘤微环境中解体，PC6AB特异性裂解GL261细胞膜产生免疫原性，协同MnP和ADU激活BV2细胞的STING通路，产生显著的免疫激活效应。

图4 纳米激动剂在体外刺激cGAS-STING通路介导的免疫激活。（a）纳米激动剂激活STING通路的机制示意图；（b）不同处理后BV2细胞中P-STING免疫荧光的CLSM图像；（c）不同处理后用GL261细胞上清液处理的BV2细胞中STING、P-STING、TBK1、P-TBK1、IRF3和P-IRF3表达水平的Western blot分析；（d-f）上述共培养体系中不同处理后免疫刺激细胞因子（包括IFN-β（d）、IFN-γ（e）和TNF-α（f））的分泌水平；（g-i）不同处理后与GL261细胞共孵育的BV2细胞中CD80+/CD86+（g）、CD3+/CD4+（h）和CD3+/CD8+（i）表达水平的代表性流式细胞术图像，不同处理包括：（I）对照组，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU，所有流式细胞术实验均独立重复三次，结果相似；（j）用NP-MnP-ADU和PBS处理的细胞中基因表达的heat map；（k）对比NP-MnP-ADU处理组和PBS处理组细胞的差异表达基因进行KEGG分析，所有数据以均值±标准差（n=3）表示

为验证纳米激动剂能否增强肿瘤特异性免疫，设计了GL261肿瘤细胞和BV2免疫细胞的共培养系统模拟肿瘤微环境。ELISA测定显示，与对照组相比，NP-MnP-ADU处理下IFN-β、IFN-γ和TNF-α水平显著增加，表明STING通路被激活（图4d,f）。NP-MnP-ADU处理使BV2细胞中CD80/CD86阳性细胞数量显著增加（图4g），表明BV2细胞成熟度增强。共培养体系中，CD3+/CD4+T细胞和CD3+/CD8+T细胞数量显著增加（图4h,i），表明BV2细胞采取类似抗原呈递细胞的表型。RNA测序结果显示，NP-MnP-ADU处理的细胞中Ifnb1、Cxcl2和Ccl5基因上调（图4j），表明其诱导细胞因子和干扰素释放。GO分析显示，NP-MnP-ADU处理影响与IFN-β应答、细胞因子产生调控和免疫反应相关的通路中的基因表达（图S17）。KEGG富集分析鉴定出TNF信号通路、细胞质DNA传感通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等关键生物学通路（图4k），表明NP-MnP-ADU通过DNA传感机制激活STING通路，诱导细胞因子和干扰素释放，发挥抗肿瘤免疫作用。

（4）体内抗肿瘤作用

纳米激动剂NP-MnP-ADU在GL261原位胶质瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效得到进一步研究。该纳米激动剂由具有膜溶解活性的PC6AB与MnP耦合而成，封装了STING激动剂ADU。通过将GL261细胞植入小鼠尾状核建立动物模型，肿瘤植入后五天，小鼠每五天接受PBS、NP、MnP、NP-MnP、ADU或NP-MnP-ADU的治疗，共15天（图5a）。纳米激动剂通过脑内注射（CED）以0.75 mg/kg的剂量递送，有效跨越血脑屏障并显示出高生物相容性。研究还全面监测了纳米激动剂在全身给药后对接种GL261肿瘤的C57BL/6小鼠模型的毒性。结果显示，各组小鼠的关键肝指标（丙氨酸氨基转移酶，ALT和天冬氨酸氨基转移酶，AST）和肾指标（尿素和尿酸，UA）均在正常范围内，无显著变化，表明纳米激动剂未诱导肝或肾毒性（图5b–e）。此外，不同组小鼠的体重变化微乎其微（图5g），表明CED治疗比腹腔注射更安全，且未检测到可观察的毒性。

图5 局部肿瘤内给予纳米激动剂消除了已建立的肿瘤。（a）建立和治疗小鼠模型的时序示意图；（b-e）不同治疗后48小时血清中ALT（b）、AST（c）、UREA（d）和UA（e）的浓度，以评估其肝毒性和肾毒性，不同处理包括：（I）对照组，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU，所有数据以均值±标准差（n=4）表示，采用单因素方差分析法进行统计分析，P值大于0.05表示无显著差异；（f）不同治疗后小鼠的肿瘤生长抑制曲线；（g）治疗期间小鼠的体重变化；（h）不同治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积监测；（i）通过CED单剂量给予NP-MnP-Cy5后健康和荷瘤小鼠的实时MRI图像；（j）通过CED单剂量给予NP-MnP-Cy5后MRI信号强度的变化；（k）通过CED单剂量给予NP-MnP-Cy5后健康和荷瘤小鼠的实时荧光图像；（l）通过CED单次给药NP-MnP-Cy5后荧光信号强度变化；（m）不同处理后脑组织样本的H&E染色结果，所有数据以均值±标准差表示（n=4）

NP-MnP-ADU在小鼠GL261肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤效果。PBS处理的小鼠肿瘤呈指数增长，20天后肿瘤大小增加到约32.6 mm³。NP、ADU和MnP治疗中等程度地抑制了肿瘤进展，平均肿瘤大小约为13 mm³，三者之间肿瘤大小无显著差异（图5f）。相比之下，NP-MnP-ADU治疗显示出最显著的肿瘤抑制效果，平均最终肿瘤大小约为3.42 mm³（图5h）。H&E染色显示纳米激动剂治疗期间癌细胞出现明显的核碎片化和核溶解（图5m），表明NP-MnP-ADU通过整合化疗和免疫疗法具有强大的抗肿瘤疗效。

为监测NP-MnP-ADU在肿瘤组织中的分布及其pH响应成像，评估了CED单剂量注射NP-MnP-Cy5（3µL）后胶质瘤小鼠的T1加权MRI和荧光图像。T1加权MRI显示，注射NP-MnP-Cy5后，GL261肿瘤模型小鼠的肿瘤实现了快速对比增强（图5i），而健康小鼠的T1对比度未显示任何增强，表明pH触发的锰释放对肿瘤探测至关重要。注射后，对比度在10分钟内迅速增加并维持约3小时，具有足够的肿瘤特异性，而健康小鼠的信号几乎未改变（图5j）。荧光成像显示，NP-MnP-Cy5在肿瘤部位的荧光信号强度显著高于对照组，而健康小鼠中未出现明显的NP-MnP-Cy5荧光信号（图5k,l）。48小时后，处死小鼠并对切除的主要器官进行成像，以分析NP-MnP-Cy5的代谢途径。 

（5）NP-MnP-ADU 激活抗肿瘤免疫

NP-MnP-ADU治疗显著增强抗肿瘤免疫反应。流式细胞术分析显示，NP-MnP-ADU治疗的GL261肿瘤小鼠中CD80+/CD86+表达是对照组的4.3倍（图6a）。治疗后，肿瘤中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量显著增加（图6b,c）。此外，NP-MnP-ADU治疗增加了促炎M1巨噬细胞表型（图6d），表明其可介导M2巨噬细胞向M1表型极化，减轻免疫抑制。血清中IFN-β、IFN-γ和TNF-α水平显著增加，而IL-10降低（图6e–h），表明促炎细胞因子介导了抗肿瘤免疫反应。免疫荧光成像显示肿瘤组织中P-STING、P-TBK1和P-IRF3蛋白过表达（图6i），表明免疫反应通过cGAS-STING通路激活。NP-MnP-ADU通过激活cGAS-STING通路、促进T细胞激活和增加M1巨噬细胞比例，增强免疫细胞反应并抑制肿瘤生长。

图6 纳米激动剂激活cGAS-STING通路促进细胞因子释放和免疫系统激活。（a-d）体内治疗后GL261肿瘤组织中CD80+/CD86+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+和F4/80/CD80+表达水平的代表性流式细胞术图像；（e-h）不同治疗后血清中IFN-β、IFN-γ、IL-10和TNF-α的分泌水平；（i）不同治疗后肿瘤中P-STING表达水平的免疫荧光分析，黄色：P-STING，蓝色：细胞核。不同处理包括：（I）对照，（II）NP，（III）MnP，（IV）NP-MnP，（V）ADU和（VI）NP-MnP-ADU。流式细胞术实验独立重复3次，结果相似，数据以均值±标准差（n=3）表示