上海交通大学周明良、蒋欣泉团队提出一种基于工程化巨噬细胞膜伪装的纳米诱饵（LMCNDs）治疗牙周炎的策略。LMCNDs将重组人抗菌肽LL-37锚定于富含Toll样受体的巨噬细胞膜上，并结合级联催化系统（包括L-氨基酸氧化酶和中空二氧化锰）。该策略通过巨噬细胞膜伪装增强细菌靶向性和组织保留能力；LL-37破坏细菌膜完整性，实现高效杀菌；级联催化系统加速氧气生成、扰乱病原菌代谢，改善缺氧微环境。同时，LMCNDs触发NF-E2相关因子-2（NRF2）核转位，减轻氧化应激，调控巨噬细胞极化，促进成骨细胞成骨分化。相关成果于2025年4月10日以《Engineered Macrophage Membrane-Camouflaged Nanodecoys Reshape the Infectious Microenvironment for Efficient Periodontitis Treatment》为题发表于《ACS Nano》。（DOI：10.1021/acsnano.4c14305）。

研究示意图

（1）LMCNDs 的制备与表征

为制备重组人LL-37（rhLL-37）修饰的活化巨噬细胞膜，将设计的慢病毒载体转染RAW264.7细胞，并用牙龈卟啉菌源性脂多糖（LPS）处理（图1A）。免疫染色结果显示，慢病毒转染的RAW264.7细胞（RawrhLL-37OE）表面LL-37水平升高，LPS处理增强巨噬细胞中TLR2/4的表达，且LPS孵育略微增加细胞质中LL-37的表达（图1B）。收集rhLL-37修饰的巨噬细胞膜（acLMMs），通过聚碳酸酯多孔膜反复挤压制备acLMM囊泡。LMCNDs的核心是载有L-氨基酸氧化酶（LAAO）的中空二氧化锰（hMnO₂），其LAAO负载效率和容量分别为50.1±5.19%和326.3±35.52 μg/mg。通过超声和连续挤压acLMM囊泡与LAAO−hMnO₂纳米颗粒（NPs）的混合物获得LMCNDs。透射电子显微镜（TEM）显示LAAO−hMnO₂NPs呈典型球形且具有空心结构，LMCNDs呈均匀且单分散的球形“核壳”形态，TEM元素映射观察到LMCNDs外层中的碳、氧、氮和锰元素，证实了LAAO−hMnO₂核心的成功封装（图1C）。LMCNDs的zeta电位与acLMMs相近，与LAAO−hMnO₂有显著差异，表明细胞膜成功包覆于载体上（图1D）。动态光散射（DLS）显示，acLMM囊泡的平均直径为162.46nm，LAAO−hMnO₂的尺寸因acLMMs的包覆从130.06增加到179.3nm（图1E）。WB结果显示，慢病毒转染和LPS刺激显著增强巨噬细胞中LL-37、TLR2和TLR4的表达，acLMM囊泡和LMCNDs的蛋白谱与活化巨噬细胞高度相似，表明保留了LL-37和病原体靶向受体。这些结果表明修饰后的巨噬细胞膜成功装饰于纳米颗粒，并保留了纳米诱饵精准递送的关键受体。

图1 LMCNDs的制备与表征。（a）rhLL-37质粒设计及LMCNDs制备示意图；（b）免疫染色评估不同巨噬细胞蛋白水平，RAW264.7细胞转染慢病毒后记为RawLL-37OE；（c）透射电子显微镜（TEM）及元素映射观察结果；（d）LAAO−hMnO₂纳米颗粒、活化巨噬细胞膜（acMMs）、经LL-37修饰的活化巨噬细胞膜（acLMMs）及LMCNDs的Zeta电位；（e）通过动态光散射（DLS）测量的平均粒径；（f）通过西方印迹分析表面蛋白谱

（2）LMCNDs 的生物相容性与催化性能评估

研究人员评估了LMCNDs的生物安全性、产氧能力及活性氧（ROS）清除能力。在L929细胞、MC3T3细胞和RAW264.7细胞中测试发现，acLMMs具有剂量依赖性的轻微细胞毒性，2 mg/mL以下的acLMMs对细胞活力几乎无影响，后续实验采用1 mg/mL的acLMMs制备样品（图2A）。优化LAAO−hMnO₂纳米颗粒浓度时，增加LAAO−hMnO₂可加速氧气生成，但包载于acLMMs中会降低细胞活力，超过200 μg/mL时显著诱导细胞凋亡，因此选择200 μg/mL和1 mg/mL分别为LMCNDs的纳米颗粒核心和细胞膜包覆层的最佳浓度（图2B、图2C）。LMCNDs在80分钟内可清除近80%的H₂O₂，且细胞膜包覆层未干扰hMnO₂介导的催化反应（图2D）。200 μg/mL的LAAO−hMnO₂包载于acLMMs中可中和细胞内ROS，具有满意的生物安全性（图2E）。LMCNDs在生理温度下保持稳定的催化能力，反应速率与LAAO相当，且在反应后期催化速率超过LAAO（图2F）。pH变化对H₂O₂分解影响较小，不同pH下L-Trp的氧化程度虽有波动，但几乎有一半被催化（图2G、图2H）。LMCNDs在H₂O₂和L-Trp混合溶液中产氧能力更强，归因于LAAO提供的过量局部H₂O₂（图2I）。在缺氧条件下，LMCNDs因封装的hMnO₂持续供应氧气，继续消耗L-Trp，而LAAO组中L-Trp浓度保持在总量的近90%（图2J）。

图2 LMCNDs的生物相容性与催化性能评估。（a）不同浓度LAAO−hMnO₂的产氧能力；（b）封装不同剂量LAAO−hMnO₂的LMCNDs的生物相容性；（c）用不同浓度LAAO−hMnO₂处理的细胞凋亡情况；（d）LMCNDs对H₂O₂的清除能力；（e）DCFH染色评估细胞内ROS水平；（f）不同样品的L-Trp消耗量；（g）不同pH条件下LMCNDs的催化效率；（h）不同pH条件下LMCNDs的催化效率；（i）不同样品催化的O₂产生量；（j）在37°C、pH=7.4的缺氧条件下，不同组L-Trp浓度的变化

（3）LMCNDs 的抗菌特性

临床前实验和临床试验结果表明，微生物群生物膜可能在24小时内迅速形成，强调了药物保留时间超过24小时的重要性。为评估LMCNDs在牙周袋中的保留情况，将FITC标记的纳米颗粒用acLMMs包裹后注入患有牙周炎的小鼠牙龈袋中。水凝胶组中，FITC标记的纳米颗粒在12小时内迅速减少，48小时后荧光信号消失；LMMs涂层延长了纳米颗粒在组织中的保留时间至24小时，但48小时后几乎无法检测；而acLMMs包裹的纳米颗粒在组织中的保留时间显著延长至48小时，表明其具有高效的细菌结合能力（图3A）。与四环素纤维和米诺环素软膏等商业产品相比，LMCNDs实现了更高的组织保留效率且临床操作更便捷。体外测试表明，acLMMs显著增强了对牙龈卟啉单胞菌（P.g.）和福赛拟杆菌（F.n.）的抗菌效果，且呈剂量依赖性，在2 mg/mL时达到峰值（图3B、C）。LAAO−hMnO₂的协同作用进一步提高了抗菌效果，使1 mg/mL的acLMMs（即LMCNDs）的抗菌活性提升至与2 mg/mL的acLMMs相当的水平。高分辨率荧光显微镜和透射电子显微镜（TEM）揭示了LMCNDs的作用机制：LMCNDs通过TLR2、TLR4和LPS之间的特异性亲和力粘附到细菌上，再通过rhLL-37介导的膜融合整合到细菌膜中，最终通过rhLL-37的成孔效应破坏细菌膜完整性导致细胞裂解（图3D、E）。此外，LMCNDs对生物膜形成有显著抑制效果，与对照组相比，acLMMs和LMCNDs组中表示死亡微生物的红色荧光信号比例显著增加，生物膜厚度急剧减少（图3F、G）

图3 LMCNDs的抗菌特性。（a）通过活体成像系统测试FITC标记的纳米颗粒在不同涂层下的牙周袋保留情况，涂层包括水凝胶、GelMA、LMMs、acLMMs；（b）不同样品对P.g.和F.n.的体外抗菌效果；（c）P.g.和F.n.的菌落形成单位计数；（d）通过高分辨率荧光显微镜观察LMCNDs的杀菌过程，箭头指示LMCNDs；（e）通过TEM观察LMCNDs的杀菌过程，箭头指示LMCNDs；（f）不同处理对细菌生物膜的死/活染色；（g）生物膜厚度分析

（4）LMCNDs 对巨噬细胞极化及成骨细胞成骨分化的调节作用

LMCNDs在脂多糖（LPS）刺激下可逆转M1/M2巨噬细胞比例（图4A）。LPS使巨噬细胞中M1标志物iNOS显著上调，acLMMs抑制M1极化并增强M2标志物CD206表达。LMCNDs孵育使M2标志物最显著上调，M1标志物最显著下调，成功实现巨噬细胞表型转变。巨噬细胞基因表达谱进一步证实了LMCNDs的免疫调节作用（图4B）。研究人员提取经LPS处理（有或无LMCNDs）的巨噬细胞培养液，与成骨培养液混合制成条件培养液（CM），诱导成骨细胞成骨分化。结果显示，与对照组相比，LPS组细胞外基质矿化受损，ALP和ARS染色较浅；LPS + LMCNDs组染色最深（图4D）。ALP定量分析表明LMCNDs挽救了炎症微环境对钙沉积和矿化结节形成的负面影响（图4E）。qPCR分析显示，成骨标志物在LPS组中下调，但在LPS + LMCNDs组中恢复（图4F）。这些结果表明LMCNDs通过重塑巨噬细胞表型，重构炎症微环境，挽救了成骨细胞的成骨分化潜能。

图4 LMCNDs对巨噬细胞极化及成骨细胞成骨分化的调节作用。（a）通过免疫染色检测巨噬细胞中M1标志物（iNOS）和M2标志物（CD206）的表达；（b）不同条件下巨噬细胞表面标志物的表达谱；（c）制备用于成骨诱导的条件培养液（CM）；（d）经不同CM诱导7天和14天后成骨细胞的ALP和ARS染色；（e）ALP活性定量分析；（f）成骨相关基因表达的qPCR分析

（5）LMCNDs 介导的巨噬细胞极化机制

LMCNDs在感染微环境下恢复巨噬细胞极化平衡的机制研究显示，对LPS诱导的RAW264.7细胞（有或无LMCNDs处理）进行RNA测序分析，发现LPS组和LPS+LMCNDs组基因表达模式存在明显差异，LPS+LMCNDs组有1229个基因上调、752个基因下调（变化倍数>2，p<0.05）（图5A）。具体表现为M2型巨噬细胞标志物显著上调，M1型标志物水平明显下降。LPS+LMCNDs组中抗氧化通路显著增强（图5B），提示LMCNDs的免疫调节效应可能源于抗氧化相关基因的上调。图5C列出了抗氧化通路中的特定基因，其中一些富集基因是NRF2的下游靶标。NRF2对抵御氧化/外来物质应激至关重要，可缓解炎症。PPI分析发现35个基因中有15个与NRF2相互作用（图5D），推测LMCNDs通过激活NRF2触发抗氧化进程，重新编程M1/M2巨噬细胞比例。免疫荧光染色和共定位分析显示，添加LMCNDs后，巨噬细胞中NRF2的核信号明显增加（图5E），且随孵育时间延长，NRF2核水平上升，细胞质中NRF2水平下降（图5F）。用NRF2抑制剂ML385阻断NRF2激活后，LMCNDs诱导的抗氧化蛋白HO-1上调显著受阻（图5G）。在LPS刺激下，无论是否存在LMCNDs，巨噬细胞中ROS水平失控（图5H），导致巨噬细胞M2转化受阻（图5I）。综上，LMCNDs通过触发NRF2核转位对抗氧化应激，规范感染微环境，助力巨噬细胞从M1向M2转化。

图5 LMCNDs介导巨噬细胞极化的机制。（a）展示LPS+LMCNDs组与LPS组之间差异基因的火山图；（b）KEGG通路分析显示LPS+LMCNDs组中富集的前15条通路；（c）KEGG通路分析显示与富集通路相关的上调基因，部分NRF2下游靶标基因以红色突出显示；（d）与抗氧化途径相关的基因的蛋白-蛋白相互作用分析；（e）免疫荧光染色及共定位分析显示不同处理后巨噬细胞中NRF2与细胞核的共定位；（f）细胞分级实验及西方印迹确定NRF2的亚细胞定位；（g）加入NRF2抑制剂ML385后，HO-1蛋白水平变化；（h）不同处理组巨噬细胞内ROS水平；（i）不同条件下巨噬细胞极化诱导情况

（5）LMCNDs 在小鼠牙周炎模型中的治疗效果

小鼠在放置围绕上颌第二磨牙的细菌斑块保留结扎线前进行了7天的适应，并待其患上牙周炎（图6A）。随后每只小鼠每2天分别接受一次PBS（对照组）、acLMMs（acLMMs组）或LMCNDs的局部注射，持续2周，第14天收集样本进行放射学和组织学分析。研究人员收集心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行苏木精-伊红（H&E）染色，未观察到acLMMs或LMCNDs处理的小鼠有明显形态变化或炎症反应，表明纳米诱饵具有可接受的生物安全性。结扎模型中观察到显著的水平向牙槽骨吸收，表现为骨体积减少和CEJ−ABC距离增加。与对照组相比，acLMMs组骨丢失部分减少，但牙槽骨高度仍位于牙根的尖部三分之一处。LMCNDs组显示出最显著的骨再生，挽救了颊侧或腭侧的骨丢失，牙槽骨高度恢复到根分叉水平（图6B、图6C）。H&E和Masson三色染色显示，对照组中牙周炎导致大量牙槽骨吸收和纤维变形降解，牙周韧带排列稀疏紊乱；而生物材料治疗的小鼠牙周组织恢复，LMCNDs组表现出最强的骨再生，牙根与牙槽骨之间通过紧密、有组织的牙周韧带建立连接（图6D）。免疫荧光染色显示，对照组小鼠中iNOS+细胞显著积累，acLMMs给药轻微降低M1与M2比例，而LMCNDs进一步扭转巨噬细胞和炎症的恶性循环，使平衡向促进修复的表型倾斜（图6E）。LMCNDs的免疫调节和ROS清除效应重塑牙周袋中的炎症微环境，治疗后牙周微环境中的主要促炎因子表达下降，且LMCNDs组中明显的ALP阳性信号表明牙周硬组织的再生。这些结果证明LMCNDs具有显著的免疫调节能力，可促进牙周组织再生。

图6 LMCNDs在小鼠牙周炎模型中的治疗效果。（a）建立小鼠牙周炎模型及治疗流程示意图；（b）各组小鼠牙槽骨再生情况的定量分析；（c）通过微CT扫描观察小鼠牙槽骨情况；（d）收集样本的H&E和Masson三色染色，箭头指示CEJ−ABC距离；（e）牙周组织的多重免疫荧光染色