针对上述问题，南方医科大学杨斌/刘强团队制备了具有良好生物相容性的天然甘草酸（GA）和氧化苦参碱（OMT）合成的生物活性离子液体（ILs），并优化了GA-OMT（GAO）的组分比和内在形成机理。随后，制备了装载棕榈酰五肽-4（PAL-4）的GAO自组装胶束（GAO/PAL-4-SM），构建了一种创新性的递送载体。在细胞和动物光老化实验中，GAO/PAL-4-SM具有显著的促进胶原和透明质酸再生、减轻炎症和细胞凋亡、加速巨噬细胞M2极化，从而减轻皮肤皱纹和平衡皮肤弹性的能力。不仅解决了信号肽在经皮递送中的稳定性和渗透性问题，还为光老化的治疗提供了一种高效、可行的新策略。该文章于2025年1月9日以《Bioactive Glycyrrhizic Acid Ionic Liquid Self-Assembled Nanomicelles for Enhanced Transdermal Delivery of Anti-Photoaging Signal Peptides 》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202412581）。

研究示意图

（1）GAO离子液体的合成及形成机理

OMT上存在N⁺-O⁻配位键和C=O键（图1a），GAO的制造过程如图1a所示。GA和OMT以1：3摩尔比混合。1H NMR谱显示，与纯GA相比，混合后GAO的-COOH氢原子峰（12-13 ppm）消失，连接-COOH的氢原子峰（4-6 ppm）也消失（图1b）。OMT的氢原子在位置9、11和22（2.8-3.6 ppm）的峰消失或位移，表明N⁺-O⁻上的氢原子振动明显。同时，连接C=O的氢原子峰消失（图1b），表明-COOH质子已转移。FTIR分析中，与纯OMT相比，GAO的N⁺-O⁻峰（2988.74 cm⁻¹）消失（图1c），表明N⁺-O⁻是与GA连接的重要位点。DSC曲线显示，185°C时出现吸热峰，表明GAO离子液体发生相变并产生热效应。Tg曲线显示，100°C下GAO质量损失小于2.5%，证明其稳定性（图1d）。HPLC-MS结果表明，形成IL过程中未产生新物质（图1e），说明GA和OMT主要通过物理交联相互作用。GA含量增加未显著改变C=O基团位置和强度（图1f）。GA和OMT的反应机制和相互作用行为如图1g所示。

图1.GAO离子液体的合成、表征及形成机理。（a）GAO的制备过程及外观（GA/OMT比例为1:3）；（b）GA、OMT和GAO离子液体的¹H NMR谱；（c）GA、OMT、物理混合物和GAO离子液体的红外光谱；（d）GAO的DSC-Tg热分析图；（e）GAO离子液体的HPLC-MS分析；（f）不同GA/OMT比例（1:3、2:3、3:3、4:3）的GAO的¹H NMR谱；（g）GAO的反应机理

（2）GAO的流变性能和离子间相互作用

GA/OMT摩尔比为1：3的GAO表现出显著的粘度特性。其剪切粘度随剪切速率的增加而显著降低（图2a），并且随着温度的升高而降低（图2b）。在三种不同摩尔比条件下，剪切应力与剪切速率均呈良好的线性关系，表现为典型的牛顿流体（图2b）。GA/OMT摩尔比为1：3的GAO的剪切粘度高于2：3和1：6的GAO，表明其分子间相互作用更强（图2c）。分子动力学模拟（MDS）分析表明，GA/OMT摩尔比为1：3的GAO的内聚能密度（CED）值最高（5.26 × 10⁸ Kcal mol⁻¹），高于2：3（5.10 × 10⁸ Kcal mol⁻¹）和1：6（5.07 × 10⁸ Kcal mol⁻¹），说明其分子间缠结和内聚力更强（图2d）。径向分布函数（RDF）分析显示，N⁺-O⁻或C=O与-COOH之间的RDF峰均集中在<4 Å区域，表明存在氢键相互作用，且N⁺-O⁻-H（-COOH）的RDF峰高度显著高于C=O-H（-COOH），进一步证明N⁺-O⁻是OMT中与-COOH结合的关键位点（图2e）。密度泛函理论（DFT）计算表明，GAO的集中静电势（ESP）接近零，范围较低，表明其低极性和高结构稳定性（图2f，g）。独立梯度模型（IGMH）分析显示GA和OMT之间存在丰富的氢键（绿色区域），而范德华力（蓝点）较少，与RDF分析结果一致（图2h）。分子中原子（AIM）分析表明GAO具有吸引力的离子相互作用，适用于渗透增强剂（图2i）。

图2.GAO离子液体的流变性能和离子相互作用研究。（a）GAO离子液体的剪切粘度；（b）剪切应力随剪切速率变化（25℃、35℃、45℃）；（c）不同GA/OMT比例（1:3、2:3、1:6）的GAO剪切应力随剪切速率变化；（d）不同GA-OMT二元体系的分子动力学模拟（MDS）快照及CED值；（e）GA中-COOH的H原子与OMT的N⁺-O⁻或C中的O原子的距离分布函数（RDF）；（f）ESP分析；（g）IGMH分析；（h）AIM分析（GA/OMT摩尔比为1:3）

（3）GAO的生物相容性、导电性和抗凋亡作用

CCK-8试验显示所有组细胞存活率超过100%（图3a），25-800 μg/mL浓度的GAO显著促进细胞增殖（图3a）。Live&Dead染色表明所有组细胞活性良好，呈亮绿色且无红色（图3b）。当GA浓度低于800 μg/mL时，HSF细胞存活率超过100%，表明OMT制成GAO后细胞毒性降低。豚鼠皮肤组织学切片（图3c）显示，GAO处理后皮肤无明显病理变化，表皮和真皮未见坏死、糜烂、溃疡或炎性细胞浸润。GAO离子液体在5%-80%水稀释范围内均匀分散，呈透明液体状。电导率测试表明，GAO含量为20%时电导率最高，5%或10%时电导率未显著降低，但高于40%时电导率显著降低（图3d），说明水含量低于80%时GAO水溶液达到临界点，结构和性质未被破坏。细胞凋亡试验中，4.7%的HSF细胞处于坏死状态，对照组中26.85%的细胞处于晚期凋亡区（图3e）。25 μg/mL和100 μg/mL的GAO可诱导晚期凋亡细胞向正常细胞和早期凋亡细胞转化，且呈量效关系；400 μg/mL的GAO主要将晚期凋亡细胞逆转为早期凋亡细胞（图3e），表明其具有抑制细胞凋亡的潜力，有利于抗光老化。

图3.GAO离子液体的生物相容性、导电性和抗凋亡特性。（a）GAO（6.25-1600 μg/mL）孵育24小时后HSF细胞活力（n=6）；（b）25、100、400 μg/mL GAO处理的HSF细胞活/死染色；（c）GAO-SM和GAO/PAL-4-SM对豚鼠背部皮肤的刺激特性（比例尺=400 μm）；（d）不同含水量下GAO离子液体的电导率（n=3）；（e）流式细胞术检测25、100、400 μg/mL GAO处理的HSF细胞凋亡

(4) GAO/PAL-4-SM的自组装

GAO/PAL-4-SM的制备过程如图4a所示。PAL-4（1 mg/mL）在水中微溶，混合物呈浑浊不透明液体；而GAO可显著溶解PAL-4，形成澄清黄色液体，最小溶解度为20 mg/mL（图4b）。GAO/PAL-4在蒸馏水中稀释5、10和20倍后仍保持澄清透明，PAL-4浓度为1 mg/mL（图4b）。动态光散射（DLS）测量显示，5% GAO/PAL-4-SM的纳米直径约为15.377 nm，多分散指数（PDI）为0.265（图4c）。10% GAO/PAL-4-SM的纳米尺寸未显著变化，但PDI值更低，粒径分布更均匀集中，表明更稳定的纳米系统（图4d）。而20% GAO/PAL-4-SM的直径和PDI值显著增加，未能实现更稳定和均匀的纳米系统（图4e）。GAO-SM浓度为5%、10%和20%时，纳米颗粒的zeta电位分别为−13.7 mV、−14.6 mV和−16.1 mV（图4c-e）。透射电镜观察显示三种胶束均为球形，粒径与DLS结果一致（图4f）。三种GAO/PAL-4-SM均表现出明显的廷德尔光散射效应（图4c-e）。因此，选择10% GAO/PAL-4-SM进行临界胶束浓度（CMC）、FTIR和X射线衍射分析。10% GAO/PAL-4-SM的CMC值为5 mg/g，验证了胶束纳米结构的存在（图4g）。X射线衍射分析（图4h）和FTIR（图4i）结果表明PAL-4被很好地包封在GAO-SM中。

图4.GAO/PAL-4-SM的自组装。（a）GAO/PAL-4-SM的制备过程；（b）PAL-4在水和GAO-SM中的溶解度（5%、10%、20%）；（c）5% GAO/PAL-4-SM的粒径、zeta电位、PDI、粒径分布及丁达尔效应；（d）10% GAO/PAL-4-SM的粒径、zeta电位、PDI、粒径分布及丁达尔效应；（e）20% GAO/PAL-4-SM的粒径、zeta电位、PDI、粒径分布及丁达尔效应；（f）不同胶束的TEM图像（标尺=50 nm）；（g）10% GAO-SM的CMC值；（h）PAL-4、10% GAO-SM和10% GAO/PAL-4-SM的X射线衍射；（i）PAL-4、10% GAO-SM和10% GAO/PAL-4-SM的FTIR曲线

（5）GAO-SM对PAL-4渗透的促进作用

PAL-4的累积透过量在24小时内随GAO浓度增加而显著增加。10% GAO-SM使PAL-4渗透量达到对照组的5.64倍，但20% GAO时渗透量显著下降（图5a）。不同浓度GAO-SM处理后，PAL-4在皮肤中的蓄积量呈相似的促进趋势，其中10% GAO对PAL-4保留的促进作用最强（图5b）。因此，选择10% GAO-SM研究ILs-SM对PAL-4在不同皮肤层滞留的影响。与对照相比，10% GAO处理的皮下层中PAL-4保留量达到5.60倍（图5c）。为了验证体外渗透结果，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记PAL-4，观察其在有无10% GAO-SM时的动态渗透。GAO/PAL-4-SM处理的皮肤平均荧光强度显著高于对照，尤其在6小时和9小时后（图5d）。GA和OMT在皮肤中也有积累，10% GAO浓度下，SC层中GA和OMT的渗透率分别为45.5%和36.7%（图5e、f、g）。这些成分在GAO与SC组分之间的相互作用中发挥了重要作用，促进了松动的SC屏障的形成。GAO-SM对PAL-4增强渗透作用的示意图如图5h所示。

图5.GAO-SM对PAL-4透皮吸收和皮下滞留的促进作用（24 h）。（a）PAL-4在5%、10%和20% GAO-SM中的体外渗透曲线；（b）PAL-4在有无GAO-SM条件下的全皮肤累积渗透量；（c）10% GAO-SM对PAL-4在角质层（SC）和皮下层滞留的影响；（d）动态荧光图像显示3、6和9小时内，有无10% GAO-SM的FITC标记PAL-4的渗透特性；（e）不同浓度GAO ILs-SM中GA在全皮肤中的保留；（f）不同浓度GAO ILs-SM中OMT在全皮肤中的保留；（g）10% GAO-SM中GA和OMT在SC和皮下层的保留

图6.GAO促进PAL-4渗透的机制研究。（a）PAL-4或GAO/PAL-4-SM处理猪皮24 h的红外光谱；（b）DSC热分析图；（c）角蛋白残基与OMT的二维对接（黑色箭头表示与角蛋白残基形成氢键的N⁺-O键）；（d）GAO与Cer、FFA或CHO二元体系的最小能量三元构象及混合能；（e）GAO与不同SC脂质的混合能（条形图表示平均值±SD，n=4，*p<0.0001）；（f）GA或OMT处理24 h的Cer的¹³C NMR谱，¹³C NMR分析中Cer的羰基碳原子变化；（g）不同SC组分与GA或OMT之间的相互作用网络

如图7a所示，PAL-4在GAO存在时部分渗透穿过SC脂质膜，其余部分在5000 ns后被捕获在脂质中；而在无GAO时，PAL-4分子在SC脂质中积累或远离脂质界面，与体外渗透研究结果一致（图5）。GA和OMT将PAL-4分子拉至SC脂质界面，并将其包裹成类似核-壳结构的胶束，表明GAO通过提供拉动效应和纳米胶束促进PAL-4渗透（图7b）。平均力势（PMF）计算显示，PAL-4在GAO/SC脂质系统中穿透双层脂质屏障所需的拉力显著低于纯SC脂质系统（图7c）。Cer、CHO和FFA在GAO/脂质体系中的密度分布显示，CHO和Cer在脂质层中间积累，而FFA分布均匀（图7d），表明CHO和Cer为GAO结合提供了更多相互作用位点，导致更高的混合能（图6d，e）。GA和OMT更集中在皮肤-屏障界面处，而不是保留在溶液中（图7d），进一步证明它们协同减弱界面阻力以增强PAL-4渗透。PAL-4在GAO/SC脂质系统中与脂质基质的相互作用力显著弱于纯SC脂质系统（图7e），表明扩散阻力降低。PAL-4与GAO之间的相互作用显著低于GAO与皮肤之间的相互作用（图7e），表明GAO的渗透促进作用主要通过影响脂质屏障实现。掺入GAO后，PAL-4与Cer和CHO的相互作用增加，而与FFA的相互作用降低（图7f）。GA阴离子与其他成分的相互作用类似于OMT阳离子（图7g），验证了它们在改善渗透方面的同等显著作用（图4g）。GA阴离子和OMT阳离子与CHO和Cer的相互作用强于FFA（图7g），与分子对接研究一致（图6d，e）。GAO IL的渗透增强机制归因于GAO与脂质屏障（Cer和CHO）的更强相互作用，这显著减弱了PAL-4与SC脂质的相互作用，并以核-壳胶束方式将PAL-4分子向前拉入SC中（图7h）。

图7.PAL-4从GAO水溶液渗透通过SC屏障的分子动力学（MDS）分析。（a）PAL-4在S1模型中的渗透动态快照及局部放大；（b）PAL-4在S2模型中的渗透动态快照及局部放大；（c）在S1和S2模型中拉动PAL-4穿过脂质屏障所需的拉力；（d）S1和S2中FFA、Cer、CHO、GA、OMT和PAL-4在Z方向上的密度分布；（e）S1和S2中不同组分之间的总相互作用力；（f）PAL-4与FFA、CHO和Cer之间的相互作用能；（g）GA阴离子或OMT阳离子与其他组分之间的相互作用；（h）GAO离子液体通过向前拉动PAL-4将其递送到更深的皮肤层，增强与皮肤及纳米尺寸的相互作用

（7）GAO-SM对PAL-4抗细胞光老化作用的影响

GAO-SM显著促进HSF细胞对FITC标记的PAL-4的摄取，细胞摄取量约为对照组的两倍（图8a）。PAL-4显著提高HA含量，GAO-SM与PAL-4联合使用时HA含量进一步增加（图8b）。GAO-SM单独处理显著提高Col-I含量，PAL-4表现出更高的增加Col-I能力，GAO增强PAL-4对Col-I产生的促进作用（图8c）。在紫外线诱导的光老化HSF细胞模型中，GAO/PAL-4-SM显著恢复HA和Col-I含量（图8d）。光老化细胞表现出更高的ROS和TNF-α水平，更低的SOD活性；GAO/PAL-4-SM显著降低ROS（图8e）和TNF-α（图8g）水平，提高SOD活性（图8f），而单独的GAO-SM和PAL-4仅降低TNF-α水平。在紫外线诱导的细胞凋亡实验中，紫外线照射使正常细胞转化为晚期凋亡细胞（25.29%）和坏死细胞（33.57%）（图8h）。PAL-4显著降低晚期凋亡和坏死细胞比例，GAO-SM将晚期凋亡细胞转化为早期凋亡细胞和正常细胞，但对坏死细胞无作用。GAO-SM与PAL-4联合应用在降低晚期凋亡和坏死细胞比例方面表现出最高的功效（图8h）。

图8.GAO-SM增强PAL-4对HSF细胞的抗光老化作用。（a）10% GAO-SM对FTIR标记PAL-4在HSF细胞内分布的影响；（b）GAO-SM、PAL-4或两者处理后HA细胞内水平；（c）GAO-SM、PAL-4或两者处理后Col-1细胞内水平；（d）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或两者处理的Col-1细胞内水平；（e）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或两者处理的HSF细胞内ROS水平；（f）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或两者处理的HSF细胞内SOD水平；（g）UV暴露后GAO-SM、PAL-4或两者处理的HSF细胞内TNF水平；（h）GAO-SM、PAL-4或GAO/PAL-4-SM处理HSF细胞后的细胞凋亡研究

（8）GAO-SM对PAL-4抗C57/BL 6小鼠光老化作用的影响

建立了C57/BL 6小鼠皮肤光老化模型，采用UVA和UVB联合照射以评价GAO-SM对PAL-4体内抗光老化作用的增强效果。与对照组相比，照射4周后，模型组皮肤出现明显皱纹、脱皮、干燥、粗糙、色素沉着和皮革样外观（图9b）。PAL-4组皮肤仍表现出脱屑、粗糙、色素沉着和革质，表明其无法逆转光老化皮肤，可能由于其皮肤渗透性较差。而GAO/PAL-4-SM组皮肤显示出更少的皱纹和革质，更保湿、光滑且有弹性，与正常组相似。各组背部皮肤纵切片用于HE染色（图9c）和Masson三色染色（图9d），以评估表皮厚度、炎性浸润和胶原再生。治疗2周后测量各组真皮厚度。HE染色结果显示，模型组表皮最厚，伴有过度角化（图9e），导致皮肤粗糙和革质。照射4周后，真皮内出现明显炎性细胞浸润。维生素C或GAO/PAL-4-SM治疗组的皮肤表皮变薄，角质化程度降低，炎症浸润减少，更接近正常皮肤组织。纯GAO-SM或PAL-4治疗也能缓解这些症状，但效果不如GAO/PAL-4-SM显著，进一步强调了它们的协同效应。

图9.GAO增强PAL-4对光老化皮肤的修复效果。（a）UV照射及药物处理时间线；（b）不同时间点光老化皮肤的代表性图像（绿色箭头：脱屑；红色箭头：皱纹和皮革样皮肤；粉色箭头：色素沉着）；（c）H&E染色；（d）4周后光老化皮肤的Masson三色染色（黑色箭头：表皮；标尺=400 μm）；（e）表皮厚度测量（基于H&E染色）；（f）胶原蛋白相对含量（基于Masson染色）；（g）各组大鼠皮肤匀浆中Col-I、HYP、HA、GSH、MDA和SOD的含量测定

在免疫荧光检查中，GAO/PAL-4-SM处理的背部皮肤中TNF-α水平显著低于GAO-SM和纯PAL-4（图10a，f）。模型组胶原纤维含量减少、排列混乱且分布不均匀，导致皮肤出现皱纹和松弛（图9d，f）。GAO/PAL-4-SM处理后，胶原纤维排列和含量恢复到正常水平，显示出改善胶原含量损失的潜力。而纯PAL-4和GAO-SM的改善能力较弱。天狼星红染色显示，GAO/PAL-4-SM显著上调Col-I表达并降低胶原III比例，而PAL-4不能增加Col-I/胶原III比例（图10b）。ELISA定量显示GAO/PAL-4-SM显著促进Col-I含量（图9g）。羟脯氨酸（HYP）作为Col-I的关键成分，其含量在GAO/PAL-4-SM处理后显著增加（图9h）。GAO/PAL-4-SM显著提高透明质酸（HA）的产生和更新能力，与维生素C相当（图9i）。氧化应激标志物检测显示，模型组MDA水平降低，SOD和谷胱甘肽水平增加（图9j-l）。GAO/PAL-4-SM处理后，这些指标恢复正常，而PAL-4仅对MDA水平有显著效果（图9j-l）。免疫组织化学检测表明，紫外线照射增加表皮中切割的caspase-3数量，而GAO/PAL-4-SM显著抑制其表达（图10c，g）。GAO/PAL-4-SM显著降低CD11c阳性巨噬细胞百分比，增加CD206阳性巨噬细胞百分比，与阳性对照相当（图10d-i）。这些结果表明GAO/PAL-4-SM在促进M2巨噬细胞极化和抗光老化方面具有重要作用（图10j）。

图10.GAO增强PAL-4对紫外线诱导的C57/BL6光老化小鼠的抗光老化作用。（a）TNF-α免疫荧光染色（比例尺=250 μm）；（b）Col-I和III型胶原蛋白的天狼星红染色（比例尺=50 μm，黄色至红色代表Col-I，绿色代表III型胶原蛋白）；（c）裂解的caspase-3免疫组织化学染色（比例尺=250 μm）；（d）CD11c免疫荧光染色（比例尺=250 μm）；（e）CD206免疫荧光染色（比例尺=250 μm）；通过ImageJ软件评估（f）TNF-α、（g）裂解的caspase-3、（h）CD11c和（i）CD206表达的平均荧光强度；（j）GAO-SM增强PAL-4抗光老化作用的分子机制示意图