针对上述问题，南昌大学罗军研究团队受到蓝藻光合作用供氧特性及其在生物医学领域的潜在应用启发，开发了一种工程化免疫调节蓝藻囊（siRNA@Cyanzyme），用于脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍的综合治疗。该系统通过光合作用持续供氧，逆转M1型小胶质细胞极化，减少促炎因子释放，并通过MnO2@ZIF-8纳米酶清除过量活性氧，降低氧化应激。同时，该系统显著提高了siRNA-ACSL4的递送效率，抑制神经元铁死亡，恢复抑制性与兴奋性神经递质的平衡，从而改善膀胱功能障碍。实验结果表明，siRNA@Cyanzyme能够有效调节免疫微环境，抑制炎症反应，减少神经元损伤，并通过单细胞转录组分析揭示了其在微胶质细胞与神经元相互作用中的核心调控机制。该研究为脊髓损伤引发的神经源性膀胱功能障碍提供了一种创新的治疗策略，相关成果于2025年3月21日以《Effect of Engineered Cyanobacterial Capsules on a Neurogenic Bladder after Spinal Cord Injury》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c14140）。

图1 工程化蓝藻胶囊的结构和功能示意图

（1）脊髓损伤后神经源性膀胱患者的铁死亡

为了进一步阐明脊髓损伤后神源性膀胱的发生和发展机制，该研究收集了符合纳入和排除标准的脊髓损伤患者和对照受试者的血清样本，并分析了分离出的血清外泌体的组成和遗传特征。在从两组受试者采集血液后，通过超速离心提取外泌体（图2a）。TEM用于观察外泌体的粒径（大约80-100 nm）和形态（图2b）。小RNA测序和分析显示，与对照组相比，共有9个miRNA表达下调，22个miRNA表达增加（图2c）。KEGG通路富集分析表明，谷胱甘肽代谢、神经凋亡、与神经免疫微环境相关的通路以及与神经递质相关的通路（如GABA通路）的活性发生了显著变化（图2d）。因此，作者预测调节铁死亡可能对SCI后的神经源性膀胱具有治疗潜力，通过调节神经免疫微环境来影响GABA通路可能在SCI后的神经源性膀胱中发挥关键作用。因此，作者构建了一个携带siRNA-ACSL4的工程化免疫调节系统，siRNA-ACSL4是铁死亡的一个关键贡献者和调节者，以确定调节神经免疫微环境的机制，并有效减少神经细胞的铁死亡，以解决SCI后的神经源性膀胱问题。

图2 临床样本分析。（a）外泌体收集及小 RNA 测序和分析示意图。（b）外泌体的透射电子显微镜（TEM）图像。标尺=100 纳米。（c）小 RNA 的测序和聚类分析。（d）血清外泌体的 KEGG 富集分析（n≥3）

（2）siRNA@Cyanzyme 的合成与表征

采用水热法合成了ZIF-8纳米颗粒。图3a中的TEM图像显示，MnO₂ NPs均匀分布在整个ZIF-8壳层基质中。通过XPS（图3b）进一步验证了MnO2的存在。MnO₂@ZIF-8的EDS映射图像也证明了成功制备（图3c,d）。海洋蓝藻PCC7942，一种淡水光合微生物，具有光合作用和良好的生物相容性。通过强多价金属-酚类复合物与蓝藻表面的NPs结合，阻止MnO₂@ZIF-8的内化，从而形成纳米酶外骨骼封装的蓝藻Cyanzyme。最后通过荧光标记的MnO₂@ZIF-8的共聚焦扫描激光显微镜和琼脂糖凝胶电泳（图3f）进一步证实了siRNA@Cyanzyme的成功制备。

图3 Cyanzyme的制备和表征。（a）MnO₂@ZIF-8的TEM图像。刻度尺=150 nm。刻度尺=40 nm。（b）MnO₂@ZIF-8的XPS 光谱。（c）MnO₂@ZIF-8的EDS光谱。（d）MnO₂@ZIF-8的元素映射。刻度尺=100 nm。（e）Cyanzyme的SEM图像。刻度尺=1 μm。（f）siRNA@Cyanzyme 的CLSM图像。刻度尺=60 μm。（g）Cyanzyme氧光合作用示意图。（h）Cyanzyme、蓝藻和H₂O的氧气释放曲线。（i）Cyanzyme活性（红色=光照，白色=黑暗处理）。（j）Cyanzyme的ROS清除活性示意图。（k）Cyanzyme和蓝藻的SOD样活性。（l）Cyanzyme的OH、O^2–和H₂O₂清除能力的ESR光谱分析

（3）氧光合作用和氰酶的CAT/SOD样催化活性

图3g展示了氰酶进行氧光合作用示意图。随后通过便携式溶解氧仪分析了氰酶的氧释放情况（图3h）。在光照条件下，氰酶组表现出强烈的光合作用活性，其活性与原始蓝藻相似。确认了蓝藻囊在红光（660 nm）照射和黑暗条件下的活性，并监测了溶解氧的浓度（图3i）。SCI后过量ROS的产生会导致神经元死亡，阻碍神经功能的恢复。因此，清除ROS对于SCI后的恢复至关重要。图3j展示了ROS清除过程的示意图。与NBT孵育后，对照组混合溶液的吸光度显著高于蓝藻囊组（图3k）。随后评估了Cyanzyme组中催化H₂O₂转化为H₂O和O₂的CAT活性。蓝藻产生的CAT活性可能应对观察到的CAT类催化活性。在ESR光谱中，对应Cyanzyme组的峰强度显著降低（图3m）。值得注意的是，没有观察到羟基自由基的峰，这表明·OH的产生可以忽略不计。

（4）工程蓝藻胶囊在体外保护细胞的能力

小胶质细胞与神经元之间的相互作用对于脊髓损伤后神经源性膀胱的机制至关重要（图4a）。以大鼠小胶质细胞（RM）、大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）评估Cyanzyme的影响，发现Cyanzyme表现出良好的安全性（图4b）。蓝藻对免疫细胞中的促炎表型具有抑制作用（图4c）。流式细胞术细胞免疫荧光均表明，蓝藻在光照条件下促进了从M1到M2的转变，表现为M1标记物减少和M2标记物CD206表达增加（图4d,e）。发现MnO₂@ZIF-8消除了ROS并抑制了细胞凋亡，而包裹MnO₂@ZIF-8的Cyanzyme效果更佳（图4f）。

建立了不同的组别，并向 PC12 细胞中递送siRNA-ACSL4或siRNA@Cyanzyme，以通过共聚焦显微镜分析siRNA-ACSL4递送的效果。六小时后，与单siRNA组相比，siRNA@Cyanzyme组中大部分红色点出现在细胞质中，一些出现在细胞核中。siRNA@Cyanzyme组的荧光强度在第12小时增加（图4i,j）。蛋白质印迹分析显示，H₂O₂刺激诱导细胞发生铁死亡，导致铁死亡标记物谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）减少和ACSL4表达增加。用siRNA@Cyanzyme处理的组别ACSL4表达显著降低，同时GPX4水平升高（图4g）。此外，PCR结果证实了Cyanzyme的高递送效率，降低了ACSL4的表达（图4h）。

图4 siRNA@Cyanzyme系统介导的巨噬细胞与神经元相互作用。（a）小胶质细胞诱导神经细胞发生铁死亡的示意图。（b）不同浓度Cyanzyme对RM、PC12细胞和HUVECs细胞活力的定量分析。（c）小胶质细胞形态的普通显微镜示意图。（d）流式细胞术分析炎症相关因子，并定量分析炎症因子阳性细胞的相对数量。（e）免疫荧光染色显示iNOS表达情况。细胞核 = 蓝色，iNOS = 红色。（f）PC12细胞的ROS和凋亡检测。ROS=绿色，细胞核=蓝色，凋亡=红色。（g）WB分析铁死亡因子（包括ACSL4和GPX4）的表达，并定量分析各组铁死亡因子阳性细胞的相对数量。（h）通过PCR检测ACSL4的mRNA表达。（i,j）免疫荧光用于评估siRNA在多个时间点的递送过程。细胞核=蓝色，siRNA=红色

（5）siRNA@Cyanzyme 降低脊髓损伤后的炎症反应并恢复脊髓和膀胱的功能

建立了脊髓损伤后神经源性膀胱的体内模型（图5a）。使用小动物活体成像系统分析了荧光标记的siRNA-ACSL4在动物体内的代谢情况（图5b）。结果显示，脊髓能够在早期装载siRNA，且siRNA@Cyanzyme组的荧光水平维持时间更长。为了进一步评估siRNA@Cyanzyme恢复脊髓功能的能力，使用Basso、Beattie和Bresnahan评分在治疗期间评估脊髓功能，Basso鼠类量表（BMS）评分在第14天开始显著不同，siRNA@Cyanzyme组表现出强烈的用脚掌站立的效果，运动时躯干稳定（图5c-d）。

为了评估siRNA@Cyanzyme对膀胱功能的恢复效果，随后进行了膀胱超声检查。siRNA@Cyanzyme治疗组的液体潴留量显著减少，逼尿肌和外部括约肌之间的协同作用得到改善，排尿顺畅，表明膀胱功能得到恢复（图5e）。对膀胱进行了H&E染色病理分析，经siRNA@Cyanzyme治疗后，膀胱壁的炎症逐渐减少，纤维化得到缓解（图5f）。多重免疫荧光染色显示siRNA@Cyanzyme治疗显著增加了抗炎标记物CD206的表达，并减少了促炎标记物iNOS的表达（图5g）。总之，这些发现表明siRNA@Cyanzyme治疗调节了脊髓铁死亡，诱导GABA能神经元再生，恢复了兴奋性和抑制性神经递质平衡，恢复了膀胱功能。

图5 siRNA@Cyanzyme 系统在体内的功能。（a）建立脊髓和膀胱模型的动物处理流程图。（b）在不同时间点接受siRNA-ACSL4或siRNA@Cyanzyme处理的中小动物活体图像（1=脊髓，2=心脏，3=肝脏，4=脾脏，5=肺脏，6=双肾脏）。（c）比较各组之间的运动功能评分，包括BBB评分和BMS评分。（d）大鼠行为表达图。（e）每组在不同时间点的膀胱超声图像。（f）膀胱的H&E染色。（g）脊髓的iNOS/CD206免疫荧光染色。CD206=绿色，iNOS=红色

（6）siRNA@Cyanzyme 逆转脊髓损伤后神经源性膀胱介导的脊髓铁死亡并促进GABA能神经元功能恢复

通过临床途径富集和体外分析，验证了siRNA@Cyanzyme是否能够抑制SCI后的神经元铁死亡，从而促进膀胱功能的恢复。TEM结果显示，与模型组相比，治疗组的铁死亡显著减少（图6a），这一结果与Western blot结果一致（图6b,c）。GABA能神经元功能障碍会导致抑制性神经递质和兴奋性神经递质活性之间的失衡。siRNA@Cyanzyme通过增加GABA的表达恢复了膀胱功能。检测了siRNA@Cyanzyme对脊髓神经元中GABA相关蛋白表达的影响（图6b,d）。通过多重组织免疫荧光进一步检测了GAD2和vGLUT2的表达。结果表明，siRNA@Cyanzyme治疗组GABA相关蛋白的表达增加（图6e）。

图6 siRNA@Cyanzyme 在体内的初步机制。（a）各组的电子显微镜图像。（b）铁死亡因子和GABA相关表达的Western blot分析。（c）铁死亡因子表达的量化。（d）GABA相关表达的量化。（e）GAD2的免疫荧光染色和GABA相关蛋白表达增加。目标蛋白（GAD2）=绿色，神经元=红色，DAPI（细胞核）=蓝色

（7）神经保护作用和抗炎作用的机制探索

使用DESeq2对SCI模型组和siRNA@Cyanzyme治疗组之间的差异表达基因进行了分析。我们总结了数据，筛选标准为fold change（FC）大于2且p值小于0.05（图7a）。火山图显示了两组之间差异表达基因的情况。热图显示了siRNA@Cyanzyme治疗后表达变化最大的35个基因（图7b）。然后，我们对差异表达基因进行了GO通路和KEGG通路富集分析（图7c,d）。结果表明，几种炎症通路（与神经保护相关的；干细胞的多能性和干性；JAK/STAT3通路；NF-kappaB的负调节因子；脂质代谢）的活性发生了显著变化。JAK-STAT3通路是参与小胶质细胞极化和免疫微环境调节的经典通路。

神经保护基因表达增加（治疗后Mapk10表达相对增加，Gabrg2表达相对增加，Slc32a1表达相对增加；图7e）表明，siRNA@Cyanzyme治疗激活了SCI区域与神经保护相关的基因通路。与脂质代谢相关的基因Slc17a7和Akr1b7表达减少，表明siRNA@Cyanzyme通过清除ROS和减少神经元铁死亡发挥治疗作用（图7f）。因此，siRNA@Cyanzyme可能通过JAK-STAT3通路抑制小胶质细胞的M1型极化，从而调节免疫微环境，抑制铁死亡，诱导神经保护，并对SCI后的膀胱功能障碍发挥治疗作用（图7g）。

图7 siRNA@Cyanzyme的机制探索。（a）基于全转录组RNA测序的差异表达基因火山图（灰色：无显著差异的基因；红色：上调基因；蓝色：下调基因）。（b）差异表达基因热图。（c、d）差异表达基因的GO通路和KEGG通路富集分析。（e、f）参与神经保护和炎症通路差异表达基因的分析。（g）siRNA@Cyanzyme 治疗机制的示意图

（8）工程化蓝藻胶囊对巨噬细胞-神经元相互作用的影响

为了研究siRNA@Cyanzyme对细胞相互作用的影响，该研究收集了接受不同治疗的鼠脊髓样本，并进行了单细胞转录组测序（图8a）。图8b和8c显示了siRNA@Cyanzyme组和SCI组之间细胞簇的比例，发现簇1和簇3的比例增加，簇7在治疗组中是独特的（图8d）。细胞内铁代谢可能与轴突再生过程协同作用（图8e）。

随后通过CellChat分析生成了整合的细胞间通讯网络，以分析细胞类型之间的显著配体-受体关系，从而确定小胶质细胞与神经元之间相互作用的强度。图7f和7g显示，siRNA@Cyanzyme组中小胶质细胞簇7与多种神经元类型的相互作用在数量和强度上均有所增加（图8h）。在小胶质细胞簇7的配体细胞与GABA能神经元的受体细胞之间的通讯链接中，Negr1、Nrg4、NCAM1、Nrxn1、Nrxn2、Nrxn3和Cntn1在siRNA@Cyanzyme处理后表达上调（图8i），基因与神经元识别、轴突连接、神经系统发育和突触形成密切相关，揭示了这些11个基因可能是siRNA@Cyanzyme介导的小胶质细胞与神经元之间通讯的核心靶点。因此，siRNA@Cyanzyme可以调节小胶质细胞与神经元之间的相互作用，从而促进SCI引起的神经源性膀胱的恢复。

图8 单细胞转录组分析。（a）单细胞转录组测序示意图。（b）siRNA@Cyanzyme组和SCI组之间整合的单细胞转录组的UMAP 表示。细胞按簇着色。（c）siRNA@Cyanzyme组和SCI组的总结图。（d）按组拆分的微胶质细胞簇图。（e）siRNA@Cyanzyme和SCI组通过微胶质细胞的GO术语。（f）CellChat 确定的差异交互数量。（g）微胶质细胞和脊髓细胞之间的差异交互强度。（h）两组中差异神经元比例。（i）气泡图展示了 siRNA@Cyanzyme 介导的通信的核心靶点