针对上述问题，上海交大张琴团队研究开发了一种注射型温敏水凝胶平台，结合蓝藻与高原子序元素氧化镧（La₂O₃）纳米粒。水凝胶局部释放治疗成分，通过三重机制协同增强放疗：①蓝藻光合作用产氧，缓解肿瘤缺氧，提高放疗敏感性；②La₂O₃纳米粒通过光电效应增强局部辐射剂量，产生活性氧，加重DNA损伤；③联合激活GSDMD和GSDME介导的焦亡，突破传统凋亡耐受。该策略融合“产氧增敏–焦亡诱导”，显著提升放疗效果。该文章于2025年04月26日以《Microbial Photosynthetic Oxygenation and Radiotherapeutic Sensitization Enables Pyroptosis Induction for Combinatorial Cancer Therapy》为题发表于《AM》上。（DOI: org/10.1002/adma.202503138）

图1 放射增敏La₂O₃ NPs-蓝藻-温敏水凝胶的合成过程及治疗途径示意图。（a）放射增敏La₂O₃ NPs-蓝藻-温敏水凝胶的合成过程；（b）放射增敏La₂O₃ NPs-蓝藻-温敏水凝胶对癌细胞死亡的治疗途径

（1）细胞焦亡相关基因与临床肿瘤大小的相关性

焦亡与肿瘤发展的关系复杂，既有促进也有抑制作用，具体效果取决于肿瘤类型及微环境。研究表明，在直肠腺癌（READ）中，GSDMD作为抑癌因子，其高表达与良好预后相关。GSDME也能抑制结肠癌细胞生长，但在肿瘤组织中常因启动子甲基化（65%）而下调表达。相反，GSDMC在结肠癌中上调，促进细胞增殖与肿瘤形成。本研究将临床结直肠癌样本按5 cm大小分组，通过单细胞RNA测序和UMAP降维（图2a）发现，小肿瘤中GSDMB、GSDMD、IL-18、CASP11、CASP3及NFKB1等焦亡相关基因表达显著高于大肿瘤。此外，炎症趋化因子CXCL1在小肿瘤中也上升。这些结果提示焦亡在结直肠癌发生发展中可能具有抑制作用。

图2 临床肿瘤差异评估及La₂O₃ NPs与蓝藻的表征。（a）不同结直肠肿瘤样本中细胞焦亡相关基因表达谱的UMAP图；（b）蓝藻细胞负染色的Bio-TEM图像及放大图像（比例尺：原始图像5 µm，放大图像1 µm）；（c）La₂O₃ NPs的暗场TEM图像；（d）La₂O₃ NPs的明场TEM图像（比例尺25 nm）；（e）La₂O₃ NPs的La元素映射图像；（f）C元素映射图像；（g）O元素映射图像（比例尺25 nm）；（h）La₂O₃ NPs的SAED图样（比例尺2 1/nm）；（i）La₂O₃ NPs的HRTEM图像及放大图像（比例尺：原始图像5 nm，放大图像1 nm）；（j）La₂O₃ NPs的X射线衍射图；（k）La₂O₃ NPs的宽扫描、La 3d和O 1s的XPS光谱

（2）蓝藻和La₂O₃ NPs-Gel 的制备与表征

通过生物透射电镜（bio-TEM）结合负染观察（图2b），发现蓝藻呈杆状，表面有由胞外粘性物质（如多糖和蛋白质）形成的膜结构，内部可见类囊体堆叠。La₂O₃纳米粒子（NPs）通过固相反应法合成，具有形貌均一的特点（图2c,d），动态光散射分析显示粒径约为145.17 ± 58.49 nm。元素分析确认其包含La、C、O（图2e–g），SAED图呈现清晰的六方晶系（图2h），高分辨率电镜（HRTEM）显示0.22 nm的晶面间距，对应 La 的（012）晶面（图2i）。X射线衍射进一步确认了其晶体结构（图2j），XPS分析揭示La和O的化学状态（图2k）。为便于加载至可注射热敏水凝胶中，合成过程中用聚乙二醇修饰La₂O₃ NPs。冻干后的水凝胶呈多孔结构（图3a），能量色散光谱显示其含有C、O、Cl、Na元素（图3b–f）。流变学测试表明，空白水凝胶与La₂O₃ NPs-Gel的溶胶-凝胶转变温度分别为31.72°C和32.23°C（图3g,h），在室温（25°C）下为液态（图3i,j），可实现体内快速成胶。FTIR证实了水凝胶中壳聚糖的特征峰（1636 cm⁻¹）（图3k）。体外释放实验表明，在pH 5.5下，La₂O₃ NPs释放更快（图3l），说明该体系可在肿瘤微酸环境中实现控释，减少系统毒性。

图3 La₂O₃ NPs-Gel的表征。（a）温敏水凝胶的SEM图像（比例尺100 µm）及元素映射图像：（b）C、（c）O、（d）Cl、（e）Na（比例尺100 µm）；（f）温敏水凝胶中元素比重分布；（g）温敏水凝胶和（h）La₂O₃ NPs-Gel的储能模量和损耗模量的温度依赖性；（i）温敏水凝胶和（j）La₂O₃ NPs-Gel的储能模量和损耗模量的时间依赖性；（k）壳聚糖、La₂O₃ NPs、温敏水凝胶和La₂O₃ NPs-Gel的FTIR光谱；（l）不同pH值下La₂O₃ NPs-Gel中La₂O₃ NPs的释放比例随时间变化（数据以平均值±标准差表示，n = 3）

（3）蓝藻的光合氧合能力

为改善缺氧的肿瘤微环境并增强放疗敏感性，利用便携式溶解氧（DO）电极测定纯蓝藻悬液在660 nm激光照射下的溶解氧变化（图4a）。在20 mW cm⁻²激光强度下，20分钟内DO浓度最高增加了37 µmol L⁻¹（图4b）。随着激光功率从10到30 mW cm⁻²增加，蓝藻的光合产氧能力也增强，在30 mW cm⁻²时，20分钟内DO上升49 µmol L⁻¹，而在5×10⁷ cells mL⁻¹浓度下，20 mW cm⁻²激光照射20分钟，DO上升56 µmol L⁻¹（图4c）。进一步通过细胞内缺氧探针[Ru(dpp)₃]Cl₂验证蓝藻缓解CT26细胞缺氧的效果。将蓝藻悬液和CT26细胞分别在暗处和1% O₂低氧舱中处理以排除残余氧气后，共孵育并进行激光照射（图4d）。结果显示，仅在蓝藻+激光组，[Ru(dpp)₃]Cl₂红色荧光显著降低，与常氧（21% O₂）条件下相近（图4e）。而单独激光或单独蓝藻处理组仍保持强烈红色荧光，说明缺氧未缓解。结果表明，蓝藻可通过激光激活的光合产氧有效改善细胞缺氧。

图4 体外光合放氧。（a）溶解氧水平检测示意图；（b）不同激光功率强度下，660 nm激光辐照溶液溶解氧水平变化；（c）不同蓝藻浓度下，660 nm激光辐照溶液溶解氧水平变化；（d）不同处理后，[Ru(dpp)₃]Cl₂染色的CT26细胞的CLSM图像（比例尺20 µm）；（e）不同处理后，[Ru(dpp)₃]Cl₂染色的CT26细胞的半定量分析；（f）不同处理后，DCFH-DA染色的CT26细胞的半定量分析（I：对照组，II：La₂O₃ NPs，III：RT组，IV：La₂O₃ NPs + RT组，V：缺氧对照组，VI：缺氧La₂O₃ NPs + RT组，VII：缺氧La₂O₃ NPs + RT + 青色）；（g）不同处理后CT26细胞的ROS水平CLSM图像（比例尺100 µm）。数据以平均值±SD（n = 3）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）分析（**p < 0.01，***p < 0.001）

（4）安全性评价和细胞毒作用

基于蓝藻独特可靠的产氧能力，进一步在CT26小鼠肿瘤细胞中评估蓝藻联合La₂O₃纳米颗粒（La₂O₃ NPs）与放疗的治疗效果。首先，通过CCK-8检测蓝藻（最高至3×10⁷ mL⁻¹）和La₂O₃ NPs（最高至400 µg mL⁻¹）的细胞相容性。结果显示，低浓度蓝藻毒性较低，而La₂O₃ NPs呈剂量依赖性毒性。共聚焦显微镜观察到Cy5.5标记的La₂O₃ NPs被CT26细胞逐步摄取，8 h达峰值。随后，体外通过CCK-8检测治疗效果。CT26细胞经蓝藻处理（1×10⁷ mL⁻¹）、激光照射（660 nm, 20 mW cm⁻², 15 min）并暴露于La₂O₃ NPs（50 µg mL⁻¹）。常氧下，放疗导致细胞活性依时间下降，24 h死亡率21.3%，72 h为47.0%；联合La₂O₃ NPs后死亡率显著上升。相比之下，缺氧细胞放疗耐受性强，仅31.5%死亡。蓝藻光合产氧联合放疗在缺氧下显著提高死亡率至45.2%，加用La₂O₃ NPs后72 h死亡率达79.7%，显示出出色的放疗增敏和杀瘤潜力。

（5）体外ROS生成

活性氧（ROS）可导致细胞内DNA氧化损伤，引发DNA链断裂，进而诱导细胞凋亡、焦亡和坏死等不同形式的细胞死亡。为探究蓝藻–La₂O₃ NPs体系的放疗增敏机制，使用绿色荧光探针DCFH-DA检测ROS生成（图4f、3g）。在常氧条件下，La₂O₃ NPs组的荧光强度低于放疗（RT）组，但联合RT后，ROS水平较单独La₂O₃ NPs组提升了3.5倍。其机制可能是：La₂O₃ NPs因高原子序数增强局部能量沉积，辐射则破坏线粒体功能，共同促进ROS大量生成。然而，在缺氧条件下，RT+La₂O₃ NPs组几乎失去ROS生成能力，说明氧气对ROS产生至关重要。引入蓝藻光合产氧后，即使在缺氧环境下，也能恢复ROS水平至常氧下的程度（图4f）。结果表明，蓝藻产氧有效缓解肿瘤缺氧，重建ROS介导的放疗增敏，为克服缺氧导致的治疗抗性提供了新策略。

（6）体外放射治疗增敏

利用克隆形成实验进一步评估辐射引起的细胞损伤，在常氧与低氧（1% O₂）条件下培养CT26细胞（图5a）。低氧组的存活率（SF）明显高于常氧组，表明缺氧降低了细胞对放疗（RT）的敏感性（图5b）。即使在低浓度（12.5 µg mL⁻¹）下，La₂O₃ NPs也能显著减少克隆形成，抑制细胞增殖，展现出强放疗增敏效果。La₂O₃ NPs与蓝藻联用时，2 Gy剂量下的SF降至对照组一半，随放疗剂量增加，杀伤效果进一步增强，优于单独La₂O₃ NPs组。进一步研究发现，ROS可能通过促进DNA损伤发挥增敏作用。通过γ-H2AX标记和彗星实验检测DNA双链断裂。常氧下，La₂O₃ NPs+RT组的DNA损伤显著增加（图5d）；低氧虽抑制此效应，但蓝藻产氧可显著恢复DNA断裂（图5e）。彗星实验亦显示了不同氧环境下DNA损伤的差异（图5f、4g）。结果验证了La₂O₃ NPs的增敏效果及蓝藻缓解缺氧的能力。

图5 体外放射治疗疗效评估。（a）不同处理后CT26细胞集落形成实验；（b）不同处理（2、4和6 Gy）后存活分数；（c）集落形成检测示意图；（d）不同处理后γ-H2AX染色的CT26细胞CLSM图像（比例尺50 µm）；（e）不同处理后γ-H2AX荧光强度的半定量分析（I：对照，II：La₂O₃ NPs，III：RT，IV：La₂O₃ NPs + RT，V：缺氧对照，VI：缺氧La₂O₃ NPs + RT，VII：缺氧La₂O₃ NPs + RT + Cyan）；（f）不同处理后彗星实验的CLSM图像（原始图像比例尺200 µm，放大图像比例尺50 µm）；（g）不同处理后彗星实验尾部DNA百分比的半定量分析（I：对照组，II：La₂O₃ NPs，III：RT，IV：La₂O₃ NPs + RT，V：缺氧对照组，VI：缺氧La₂O₃ NPs + RT，VII：缺氧La₂O₃ NPs + RT + 青色）。数据以平均值±SD表示（每组n = 3；彗星实验n = 3生物学重复，每个重复3技术重复），采用单因素方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001）

（7）RNA转录组分析

为探究La₂O₃ NPs-蓝藻平台在缺氧环境下的抗癌机制，进行了转录组分析。结果显示，La₂O₃ NPs + RT + Cyan组有2298个差异表达基因（DEGs），包括1398个下调和900个上调（图6a-c）。GO分析显示，该组合上调了氧化应激相关通路，抑制了缺氧响应通路，表明蓝藻产氧改善了细胞氧合状态（图6d）。此外，炎症相关通路如NF-κB信号通路也被显著激活，提示ROS通过激活NLRP3炎症小体，促进caspase-1活化，诱导细胞焦亡（图6e-g）。GSEA分析进一步验证了炎症反应增强（图6e,f），并观察到与细胞焦亡相关的基因（如caspase-1、caspase-3、GSDMD、GSDME）明显上调（图6h）。总体结果表明，La₂O₃ NPs + RT + Cyan平台通过ROS激活NOD样受体和NF-κB通路，诱导GSDMD/GSDME裂解，形成膜孔并释放IL-1β，最终引发肿瘤细胞焦亡。

图6 不同处理后CT26细胞RNA-seq转录分析。（a）热图、（b）火山图、（c）直方图揭示缺氧条件下RT+La₂O₃NPs+Cyan和PBS处理的CT26细胞中上调或下调的基因；（d）缺氧条件下RT+La₂O₃NPs+Cyan和PBS处理的CT26细胞中差异表达基因的GO分析（BP和MF类别）；（e）差异表达基因的基因集富集分析；（f）典型NF-κB信号转导的GSEA富集图；（g）基于功能基因交叉的环形数值热图（A–C：缺氧对照组；D–F：缺氧RT+La₂O₃NPs+青色组）；（h）功能基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络

（8）体外细胞焦亡

为了进一步明确La₂O₃ NPs + RT + Cyan平台在缺氧环境下诱导焦亡的机制，采用Annexin-V/PI染色结合共聚焦显微镜明场成像（图7a）区分坏死、凋亡与焦亡。La₂O₃ NPs组细胞出现典型焦亡特征，如细胞肿胀和膜起泡。在常氧下，La₂O₃ NPs + RT组焦亡显著，而缺氧抑制了该过程，加入蓝藻氧合后焦亡恢复接近常氧水平。通过Western blot检测不同条件下GSDMD与GSDME及其剪切片段（图7b），发现La₂O₃ NPs浓度升高促进GSDMD剪切，且放疗可增强该效应（图7c）。高浓度La₂O₃ NPs还促进了GSDME剪切（图7d），表明平台可激活经典与非经典焦亡路径。进一步分析表明，缺氧降低N-GSDMD与N-GSDME水平（图7f,g），而蓝藻系统可逆转该抑制。NLRP3表达趋势也支持La₂O₃ NPs经ROS-NLRP3-GSDMD途径诱导焦亡。流式细胞术数据显示，La₂O₃ NPs + RT + Cyan组焦亡率达9.6%（图7i,j），并伴随凋亡增加，表明蓝藻氧合有助于增强细胞死亡与治疗效果。

图7 体外细胞焦亡。（a）CT26细胞放疗（6 Gy）72小时后Annexin-V&PI染色的CLSM图像（粉色箭头：大气泡；比例尺：原始图像100 µm，放大图像10 µm）；（b）放疗后72小时，不同La₂O₃浓度下GSDMD和GSDME全长及N端片段表达；（c）N-GSDMD和（d）N-GSDME的半定量分析；（e）不同处理后72小时，GSDMD和GSDME表达；（f）N-GSDMD和（g）N-GSDME的半定量分析（I：对照，II：La₂O₃ NPs，III：RT，IV：La₂O₃ NPs + RT，V：缺氧对照，VI：缺氧La₂O₃ NPs + RT，VII：缺氧La₂O₃ NPs + RT + 青色）；（h）RT-La₂O₃ NPs诱导的细胞焦亡形态示意图；（i）不同处理后Annexin V-FITC&PI染色的细胞死亡流式分析；（j）细胞焦亡百分比。数据以平均值±SD（n = 3）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）分析（**p < 0.01，****p < 0.0001）

（9）体内肿瘤放射治疗

在动物实验前，评估了La₂O₃ NPs的溶血性，结果显示Cyan + La₂O₃ NPs系统具有良好生物相容性。急性与慢性毒性检测表明，主要脏器及血液指标无异常。药代动力学研究发现，温敏水凝胶能有效将药物局限于肿瘤区，注射8天后荧光强度仍保留41.1%（图8a,b）。这种缓释行为归因于水凝胶的膨胀扩散机制和壳聚糖的可降解性，减少了系统暴露，延长了局部药物作用时间。

图8 药物代谢分析。（a）BALB/c小鼠CT26肿瘤异种移植瘤瘤内注射La₂O₃纳米颗粒和La₂O₃纳米颗粒-凝胶后的体内荧光成像；（b）瘤内注射药物滞留率的半定量分析。数据以平均值±标准差（n=3）表示

在LLC和CT26移植瘤模型中评估了治疗效果。各组小鼠体重稳定（图9b, 10b）。La₂O₃ NPs-Gel单独即可抑制肿瘤生长，联合蓝藻后进一步增强放疗增敏作用，14天后肿瘤体积明显缩小（图9c–e, 10c–e）。La₂O₃ NPs-Gel + RT + Cyan组的抑瘤率分别达94.68%和95.48%，优于其他组。肉眼观察也验证了蓝藻光合作用缓解缺氧、提升增敏效果（图9f, 10f）。

组织学分析显示主要器官无明显损伤（图9g, 10g）。肿瘤切片Ki-67和TUNEL染色表明肿瘤增殖减少、凋亡增加（图9h,k, 10h,k）。RT + Cyan + La₂O₃ NPs-Gel组中N-GSDMD和N-GSDME表达上升，且IL-6、IL-1β释放增加（图9i–m, 10i–m），提示有效诱导焦亡。NLRP3上调进一步验证了焦亡机制（图9n, 10n）。综合证实该系统通过双重增敏增强抗肿瘤效果。

图9 RT-蓝藻-La₂O₃ NPs-Gel体系体内抗CT26肿瘤疗效。（a）生物放射治疗与抗肿瘤治疗时间示意图；（b）CT26肿瘤小鼠体重变化曲线（n=6）；（c）各组肿瘤平均重量（n=6）；（d）CT26肿瘤生长曲线（每2天记录一次，n=6）；（e）不同治疗后肿瘤生长曲线（PBS、La₂O₃ NPs-Gel、RT、RT + La₂O₃ NPs-Gel、RT + La₂O₃ NPs-Gel + Cyan，n=6）；（f）各组解剖肿瘤照片（n=6）；（g）治疗后第14天小鼠主要器官H&E染色（比例尺200 µm）；（h）Ki-67、（i）IL-1β、（j）IL-6免疫组织化学染色（比例尺50 µm，n=3）；（k）TUNEL、（l）N-GSDMD、（m）N-GSDME、（n）NLRP3免疫荧光染色（比例尺50 µm，n=3）。数据以平均值±SD表示，采用单向方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）

图10 RT-蓝藻-La₂O₃ NPs-Gel体系体内抗LLC肿瘤疗效。（a）生物放射治疗与抗肿瘤治疗时间示意图；（b）LLC肿瘤小鼠体重变化曲线（n=6）；（c）各组肿瘤平均重量（n=6）；（d）LLC肿瘤生长曲线（每2天记录一次，n=6）；（e）不同治疗后肿瘤生长曲线（PBS、La₂O₃ NPs-Gel、RT、RT + La₂O₃ NPs-Gel、RT + La₂O₃ NPs-Gel + Cyan，n=6）；（f）各组解剖肿瘤照片（n=6）；（g）治疗后第14天小鼠主要器官H&E染色（比例尺200 µm，n=3）；（h）Ki-67、（i）IL-1β、（j）IL-6免疫组织化学染色（比例尺50 µm，n=3）；（k）TUNEL、（l）N-GSDMD、（m）N-GSDME、（n）NLRP3免疫荧光染色（比例尺50 µm，n=3）。数据以平均值±SD表示，采用单向方差分析（ANOVA）分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）