针对上述问题，来自四川大学华西医学院沈彬的研究团队提出了一种多重Pickering乳液模板法来制备多孔、小尺寸的微凝胶。该微凝胶由HA和PSBMA组成，通过多重Pickering乳液法制备，具高载药量、良好注射性和优异润滑性能。表面接枝软骨特异性肽SP，实现靶向递送miR-140，克服其稳定性和非靶向性问题，展现出润滑与控释的协同治疗潜力，为新一代OA载药系统提供新思路。该文章于2025年5月5日以《Advanced Injectable Microgels: Porous, Small-Sized, and Lubricated Systems for Targeted Synergistic Therapy in Osteoarthritis》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202418951）。

图1 miR-140@HS-SP微凝胶的制备原理及制备示意图

（1）利用噬菌体展示技术筛选软骨靶向肽

根据噬菌体筛选原理，先将噬菌体库与软骨细胞共孵育，去除非特异性结合后，用甘氨酸洗脱特异性结合的噬菌体并扩增，随后重复筛选三轮以富集高亲和力噬菌体（图2a）。每轮噬菌体回收量递增，第二轮较第一轮富集约20倍，第三轮趋于饱和，筛选结束。从第三轮中随机挑选20个蓝斑噬菌体测序，获得15条插入序列，推导出4种氨基酸序列（表1），其中HPTISGPANPAFGGG（HP）频率最高（8次）。ELISA结果显示，HP和SPSLIYFPKSIYGGG（SP）序列噬菌体对软骨细胞亲和力最高（图2c），因此选用HP和SP用于后续研究。

图2（a）噬菌体展示技术示意图；（b）蓝色噬菌体斑块插入的DNA序列；（c）阳性噬菌体与软骨细胞的ELISA检测；（d）荧光光谱、（e）流式细胞术、（f）流式定量分析不同肽段与软骨细胞的亲和力；（g）荧光光谱、（h）流式细胞术、（j）流式定量分析SP肽段与不同细胞的亲和力（比例尺200 µm）

（2）HS-SP 多孔微凝胶的制备与表征

为实现可注射、高效负载和持续释放 miR-140，采用多重 Pickering 乳液模板法制备小尺寸多孔微凝胶。将 HA、SBMA、Laponite 和光引发剂溶于水作为连续相，液体石蜡为分散相，形成粒径均一的稳定 O/W 初乳。再次加入石蜡制备 O/W/O 乳液，呈现独特多相结构（图 3a），优于传统 W/O 乳液（图 3b）。在紫外光照下，SBMA 交联生成粒径约 20 µm、分布均匀的多孔 HS 微凝胶（图 3c、d），而 W/O 所得微凝胶结构不均（图 3e）。随后将软骨靶向肽 SP 接枝至微凝胶表面，形成 HS-SP，荧光显微镜和 EDS 证实接枝成功（图 3f、g）。

图3（a）由多种Pickering O/W/O乳液制备的微凝胶（比例尺100 µm）；（b）由多种Pickering W/O乳液制备的微凝胶（比例尺100 µm）；（c）使用O/W/O和W/O乳液制备的HS微凝胶的粒度分布；（d）由O/W/O乳液制备的HS微凝胶的SEM图像（比例尺10 µm）；（e）由W/O乳液制备的HS微凝胶的SEM图像（比例尺10 µm）；（f）HS-SP微凝胶的光学和荧光显微镜图像（比例尺100 µm）；（g）HS-SP微凝胶的SEM图像及EDS分析（比例尺10 µm）

与微流控相比，多重 Pickering 乳液法可制备粒径小、结构均匀、比表面积大的多孔微凝胶，显著提升 miR-140 的负载能力（图4a）。该微凝胶吸水率超4000%，溶胀速率快，优于以往报道（图4b）。通过噬菌体展示技术将 SP 肽接枝于表面，形成 HS-SP 微凝胶，荧光显微镜和 EDS 验证接枝成功。流变学与力学测试显示接枝过程对微凝胶机械性能影响微弱，其较低强度有助于体内降解和药物释放。冷冻干燥后，miR-140 可通过物理吸附方式负载至微凝胶中（miR-140@HS-SP），荧光图像显示其在微凝胶内均匀分布（图4c）。此外，HS-SP 微凝胶增强润滑性能，摩擦系数从 0.085 降至 0.073（图4d），归因于 HA 与 PSBMA 的水化层形成，即便磨损也能持续暴露润滑界面。为验证生物相容性，采用活/死染色与 CCK-8 分析 HS-SP 对软骨细胞的影响。第1、3、5天检测显示细胞活性良好，形态正常，与对照组无显著差异（图4e-h）。细胞数量随时间增加，增殖速率正常，表明该微凝胶具备良好的生物相容性，适合多种生物应用。

图4（a）HS-SP微凝胶的溶胀性能；（b）不同微凝胶溶胀性能比较，数据点编号对应文献编号；（c）miR-140@HS-SP微凝胶的荧光显微镜图像（比例尺100 µm）；（d）HS-SP微凝胶的摩擦曲线；（e）共培养软骨细胞在第1、3和5天的活/死染色（比例尺200 µm）；（f）活/死染色定量荧光强度；（g）细胞活力；（h）CCK-8检测第1、3和5天软骨细胞活力结果，数据以平均值±SD表示，n≥3，P值通过t检验计算，ns表示p>0.05

（3）miR-140在软骨细胞中的靶向递送和细胞内功能

炎症和氧化应激在OA发病中至关重要。本研究以IL-1β模拟炎症微环境，诱导软骨细胞发生氧化应激和线粒体损伤，并通过流式细胞术评估miR-140的抗凋亡和清除ROS的作用。结果显示，IL-1β显著提高ROS水平（FITC均值=136.3）并增加细胞凋亡比例（11.8%），表明模型构建成功。miR-140显著抑制ROS产生（MD = -53.13，p = 0.0004）并减少凋亡（MD = -5.8，p < 0.0001），显示其具有抗氧化和细胞保护作用。此外，OA引发的线粒体功能障碍可促进ROS过量生成，加剧细胞损伤。JC-1染色结果显示，OA组线粒体膜电位降低（JC-1 Mono/Agg = 1.421），miR-140处理显著恢复膜电位（MD = -0.61，p < 0.0001），提示其可改善线粒体功能、降低ROS水平并抑制凋亡，从而延缓OA进程。

图5（a、b）流式细胞术检测软骨细胞凋亡；（c、d）软骨细胞的活性氧（ROS）；（e）软骨细胞线粒体的透射电子显微镜图像；（f）JC-1法检测线粒体膜电位；（g）JC-1单体/JC-1聚集体的定量分析（比例尺100 µm）。数据以平均值±SD表示，n≥3，P值通过t检验计算，*** p < 0.001

尽管miR-140可通过清除ROS和改善线粒体功能延缓OA进展，但其存在摄取率低、非靶向聚集、半衰期短等局限，因此需借助微凝胶进行保护与缓释。实验表明，微凝胶能实现miR-140的缓释（图6a），其中SP肽修饰赋予其靶向性。与miR-140和miR-140@HS相比，miR-140@HS-SP在软骨细胞周围表现出更强的荧光聚集，显示出更佳的递送效率（图6b）。因此，后续实验聚焦于miR-140@HS-SP组。OA破坏细胞外基质（ECM）平衡，影响Col2和Aggrecan等关键成分合成，并通过MMP13和ADAMTS5介导降解。miR-140@HS-SP与软骨细胞共培养后，显著上调Col2、Aggrecan表达，抑制MMP13和ADAMTS5（图6c-j），表明其能增强合成代谢、抑制分解代谢，具有治疗OA的潜力。

图6（a）miR-140靶向转染软骨细胞的效果（比例尺200 µm）；（b）miR-140@HS-SP缓释miR-140；（c~f）免疫荧光检测软骨细胞中聚集蛋白聚糖、Col2、ADAMTS5和MMP13的表达（比例尺200 µm）；（g~j）这些蛋白的积分荧光密度统计分析。数据以平均值±SD表示，n≥3，P值通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算，ns p >0.05，* p <0.05，**** p <0.0001

（4）骨关节炎的体内治疗效果

通过DMM手术建立OA大鼠模型，术后第1周将动物分为4组，每周进行关节腔注射（OA、miR-140、HS-SP、miR-140@HS-SP）。第4和第8周步态分析显示，miR-140@HS-SP组步行速度和步幅显著提高，运动障碍系数降低，步态恢复接近正常。影像学分析表明，miR-140@HS-SP治疗可维持较宽的关节间隙，减少游离体数量，并改善软骨下骨结构，包括骨密度升高、小梁数量与厚度增加、骨间隙减少。MRI进一步证实其软骨修复效果。结果表明，miR-140@HS-SP可有效减缓OA进展，具有良好的软骨保护和治疗潜力。

图7（a）步态分析；（b）步行周期、步行速度、步幅和运动不平衡系数的定量分析；（c）大鼠膝关节的3D CT重建；（d）膝关节骨赘和游离体的定量分析；（e）软骨下骨的微观结构分析及热图；（f）骨密度的定量分析；（g）骨体积比例、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间隙的定量分析。数据以平均值±SD表示，n≥3，P值通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算，ns p >0.05，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001

除影像学外，采用H&E和番红绿染色评估软骨组织变化。正常组软骨结构完整，ECM染色均匀，而OA组软骨严重损伤、结构紊乱，染色减弱（图8a、b）。OA组软骨厚度显著减少，OARSI评分升高；miR-140@HS-SP治疗显著改善软骨形态，厚度增加，评分下降（图8d）。免疫组织化学显示，miR-140@HS-SP组Col2和Aggrecan表达水平升高（图8e–h），提示ECM合成增强。滑膜组织染色结果还表明，治疗组中M1型巨噬细胞减少，M2型增加，M1/M2比值下降，进一步证明miR-140@HS-SP可有效减缓软骨退变、抑制OA进展。

图8（a）H&E染色；（b）番红O-固绿染色；（c）大鼠膝关节软骨厚度测量结果；（d）大鼠膝关节OARSI评分；（e）Col2免疫组化染色；（f）关节软骨中Col2阳性区域的定量分析；（g）Aggrecan免疫组化染色结果；（h）关节软骨中Aggrecan阳性区域的定量分析（比例尺250 µm）。数据以平均值±SD表示，n≥3，P值通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算，ns p >0.05，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001

（5）通过比较差异表达的mRNA可以揭示骨关节炎治疗的机制

转录组分析揭示 miR-140@HS-SP 在促进软骨再生和ECM合成中的作用。Pearson相关性和主成分分析确认各组数据具有良好重复性（R²>0.95，n=3）。差异基因分析显示，miR-140@HS-SP组与OA组相比，上调131个基因，下调1010个，表明其联合效应显著（图9a）。GO富集分析发现，OA组下调基因主要涉及ECM合成、炎症调节和细胞衰老（图9bI）。miR-140组上调ECM相关和软骨细胞增殖基因（图9bII），HS-SP组影响透明质酸合成及抗衰老通路（图9bIII），miR-140@HS-SP组则同时抑制炎症和衰老、促进软骨细胞功能（图9bIV）。蛋白互作网络和热图分析进一步证实，miR-140@HS-SP通过协同作用调控ECM组织、细胞增殖、炎症与衰老过程（图9c）。尽管具体机制尚待验证，但已有数据支持其在OA治疗中的潜力，后续研究将进一步探究其分子机制。

图9（a）miR-140@HS-SP治疗OA的机制研究。OA组与正常组（I）、miR-140组与OA组（II）、HS-SP组与OA组（III）、miR-140@HS-SP组与OA组（IV）差异表达mRNA的火山图（p值<0.05且|logFC|>1）；（b）OA组与正常组（I）、miR-140@HS-SP组与OA组（II）的下行GO富集项；miR-140组与OA组（III）、HS-SP组与OA组（IV）的上行GO富集项；（c）热图显示各组中涉及ECM生成、细胞粘附和迁移、炎症和细胞增殖的mRNA差异表达（I：OA与正常组；II：miR-140与OA组；III：HS-SP与OA组；IV：miR-140@HS-SP与OA组）