针对上述问题，中国科学院国家纳米科学中心聂广军教授、中国科学院大学张银龙教授开发了一种基于点击化学的介孔二氧化硅纳米陷阱（SiO₂-Mal），用于逆转氯吡格雷和普拉格雷的功能，以防止出血风险，研究表明其在体外和动物模型中均能有效恢复血小板聚集功能，并具有进一步开发临床应用的潜力。该研究于2025年4月8日以《Mesoporous Silica Nanotraps for Mitigating Bleeding Risk From ‘Irreversible’ Antiplatelet Drugs》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI：10.1002/adma.202501576）。

图1 研究示意图

(1) SiO₂ - Mal纳米陷阱的制备与表征

通过溶胶 - 凝胶法合成介孔二氧化硅纳米粒子并用马来酰亚胺基团功能化，形成SiO₂ - Mal纳米阱，用于捕获氯吡格雷和普拉格雷的活性代谢物。图2A展示了冻干的SiO₂ - Mal纳米阱。TEM成像显示SiO₂（图2B）和SiO₂ - Mal（图2C）均为均匀球形，直径约100 nm。DLS分析表明，SiO₂尺寸为164.3 nm，SiO₂ - Mal尺寸为173.4 nm，且分布较窄（图2D）。马来酰亚胺基团引入后，SiO₂表面电荷从 - 35.9 mV变为 - 33.9 mV（图2E）。储存三个月后，DLS分析显示SiO₂ - Mal稳定性良好（图2D、E）。N₂吸附 - 解吸分析证实了有序介孔结构，主要孔径约4.25 nm，改性后孔径略有变化（图2F - I）。SiO₂的BET表面积为773.8 m² g⁻¹，总孔容为1.26 cm³ g⁻¹，改性后SiO₂ - Mal的BET表面积为747.4 m² g⁻¹，孔容为1.18 cm³ g⁻¹。TEM映射成像和EDS分析表明硅烷 - PEG - Mal改性成功（图2J）。TGA显示改性硅烷 - PEG - Mal在SiO₂ - Mal中的含量为8.13%。马来酰亚胺定量试剂盒测得SiO₂ - Mal的马来酰亚胺基团含量为133.1±2.6 µmol g⁻¹。FTIR验证了马来酰亚胺基团修饰成功（图2K）。TEM映射成像证实SiO₂ - Mal可与活性代谢物CLP - AM或PRA - AM结合，每个SiO₂ - Mal纳米粒子可捕获1.98×10⁶个CLP - AM分子或2.86×10⁶个PRA - AM分子（图2L）。

图2 SiO₂-Mal纳米阱的表征。（A）冻干SiO₂-Mal纳米阱照片；（B-C）SiO₂和SiO₂-Mal的TEM图像（比例尺100 nm）；（D）3个月后SiO₂、SiO₂-Mal的尺寸分布；（E）3个月后SiO₂、SiO₂-Mal的Zeta电位；（F-I）SiO₂和SiO₂-Mal的N₂吸附-解吸等温线及BJH孔径分布曲线；（J）SiO₂和SiO₂-Mal的TEM映射图像（比例尺50 nm）；（K）FTIR光谱；（L）与CLP-AM或PRA-AM孵育后SiO₂-Mal的元素分布映射图像（比例尺100 nm）

（2）SiO₂ - Mal纳米陷阱与体外活性代谢物的结合能力

由于氯吡格雷和普拉格雷需经肝脏代谢成活性化合物，研究使用其活性代谢物进行体外实验。模拟计算显示，CLP - AM与P2Y₁₂受体结合能为 - 12.07 kcal mol⁻¹，与SiO₂ - Mal纳米阱马来酰亚胺基团结合能为 - 98.74 kcal mol⁻¹，表明SiO₂ - Mal对CLP - AM亲和力更强（图3A - C）。表面等离子体共振（SPR）实验测得SiO₂ - Mal与CLP - AM、PRA - AM的结合亲和常数（KD值）分别约为1.44×10⁻⁸ M和2.59×10⁻⁸ M，显示其与活性代谢物结合力强（图3D - F）。流式细胞术实验表明，随着CLP - AM浓度增加，P2Y₁₂抗体与血小板结合率降低，而SiO₂ - Mal纳米阱可浓度依赖性地增加该结合率，降低CLP - AM在静息血小板表面占据的P2Y₁₂受体比例（图3G - K）。类似地，SiO₂ - Mal纳米阱也能有效降低PRA - AM在静息血小板表面占据的P2Y₁₂受体比例（图3L - O；）。

图3 SiO₂-Mal纳米阱与CLP-AM或PRA-AM的结合能力。（A）CLP-AM与P2Y₁₂受体的优化构象结构；（B）CLP-AM与P2Y₁₂受体及SiO₂-Mal的分子结构；（D）SPR分析示意图；（E-F）SPR分析SiO₂-Mal与CLP-AM（E）或PRA-AM（F）的解离常数（Kᴅ）；（G）流式细胞术测定结合率的示意图；（H-K）流式细胞术检测CLP-AM与P2Y₁₂受体的结合率（SiO₂-Mal浓度为0、0.05、0.2、0.5 mg/mL，CLP-AM浓度为2（H）、5（I）、30（J）、60 µM（K））；（L-O）流式细胞术检测PRA-AM与P2Y₁₂受体的结合率（SiO₂-Mal浓度为0、0.05、0.2、0.5 mg/mL，PRA-AM浓度为2（L）、5（M）、30（N）、60 µM（O））

（3）SiO₂ - Mal纳米陷阱体外对CLP-AM或PRA-AM的功能逆转

血小板聚集实验表明，与PBS组相比，CLP-AM显著抑制了ADP诱导的血小板聚集，而SiO₂-Mal纳米阱的加入则有效减轻了这种抑制作用，且随着纳米阱浓度的增加，血小板聚集率显著提升（图4B、D）。类似地，PRA-AM也能抑制血小板聚集，但SiO₂-Mal纳米阱同样能以浓度依赖性方式恢复其聚集功能（图4C、E）。此外，在巴马猪和健康人类志愿者的PRP中，SiO₂-Mal纳米阱也展现出对CLP-AM的逆转效果（图S7-S10）。在体内实验中，氯吡格雷或普拉格雷处理的小鼠PRP中，ADP诱导的血小板聚集显著降低，而与SiO₂-Mal纳米阱联合使用时，聚集率显著升高，表明其在体内也能有效逆转抗血小板活性（图S11-S13）。机制上，CLP-AM与P2Y₁₂受体结合虽稳定，但血液中的还原物质（如GSH）可促进其解离，而SiO₂-Mal纳米阱通过竞争性结合CLP-AM，进一步增强逆转效果，血浆置换实验也显示血小板聚集率略有增加，表明二硫键形成是动态过程（图4I；图S14-S15）。血栓弹力图（TEG）分析显示，SiO₂-Mal纳米阱显著降低了CLP-AM和PRA-AM诱导的血小板抑制率，增加了血凝块强度（MA ADP），并缩短了凝血时间（R和K时间）（图4J-M）。血凝块形成实验直观地表明，SiO₂-Mal纳米阱显著加快了因CLP-AM和PRA-AM延迟的血凝块形成速度（图4O）。

图4 SiO₂-Mal纳米阱和CLP-AM或PRA-AM对血小板功能的影响。（A）血小板聚集试验示意图；（B-C）与CLP-AM（B）或PRA-AM（C）孵育并添加不同浓度SiO₂-Mal纳米阱后，ADP诱导的血小板聚集；（D-E）定量B（D）和C（E）中的血小板聚集率；（F）采集全血并制备富含血小板的血浆（PRP）的示意图；（G）与不同药物孵育后的人体血小板聚集率；（H）定量G中的人体血小板聚集率；（I）不同治疗组（包括CLP-AM、新鲜血浆置换或不同浓度的GSH）的血小板聚集率；（J-N）TEG血小板映射试验。（J）CLP-AM处理并添加SiO₂-Mal纳米阱的样品的ADP诱导的血小板抑制率和MAₐᴅᴘ；（K）CLP-AM处理并添加SiO₂-Mal纳米阱的样品的R时间和K时间；（L）PRA-AM处理并添加SiO₂-Mal纳米阱的样品的ADP诱导的血小板抑制率和MAₐᴅᴘ；（M）PRA-AM处理并添加SiO₂-Mal纳米阱的样品的R时间和K时间；（N）活性抗血小板代谢物和SiO₂-Mal纳米阱处理的样品的TEG血小板映射描记图及ADP诱导的血小板抑制率；（O）CLP-AM或PRA-AM处理后，使用SiO₂-Mal纳米阱的全血凝固试验

（4）SiO₂-Mal纳米阱在小鼠尾部出血模型中对氯吡格雷或普拉格雷的体内功能逆转

荧光成像显示静脉注射后SiO₂-Mal纳米阱的血液循环半衰期约为9小时且主要在肝脏、肾脏、肺和脾脏中积聚，48小时后大部分消散，表明其主要通过肝脏降解和肾脏排泄清除（图S16A-D），在小鼠尾部出血模型中，SiO₂-Mal纳米阱显著缩短了氯吡格雷引起的出血时间，逆转效率在2.5 mg/kg剂量下最高，达到89.78%（图5A-D），对于普拉格雷，SiO₂-Mal纳米阱同样以剂量依赖性方式显著减少出血时间，最大逆转效率为84.03%（图5E-G），与单独使用血小板输注相比，SiO₂-Mal纳米阱与血小板输注联合使用显著提高了逆转效率，3小时后氯吡格雷和普拉格雷的逆转效率分别达到93.01%和88.22%（图5H-K），表明联合使用可增强逆转抗血小板药物的效果，在给予氯吡格雷或普拉格雷后2.5小时，当抗血小板作用完全发挥时，注射SiO₂-Mal纳米阱可在5分钟内显著减少尾部出血时间，逆转效果与立即注射相当（图5L-O），表明其能快速起效。

图5 SiO₂-Mal纳米阱在小鼠尾部出血模型中对氯吡格雷/普拉格雷的体内功能逆转。（A）小鼠尾部出血模型示意图；（B）不同处理组小鼠的尾部出血时间（氯吡格雷组、氯吡格雷+SiO₂组、氯吡格雷+SiO₂-Mal组）；（C）不同剂量SiO₂-Mal纳米阱对氯吡格雷处理小鼠出血时间的影响；（D）B和C中氯吡格雷处理后出血时间的归一化分析；（E）不同处理组小鼠的尾部出血时间（普拉格雷组、普拉格雷+SiO₂组、普拉格雷+SiO₂-Mal组）；（F）不同剂量SiO₂-Mal纳米阱对普拉格雷处理小鼠出血时间的影响；（G）E和F中普拉格雷处理后出血时间的归一化分析；（H）血小板输注对氯吡格雷处理小鼠出血时间的影响；（I）H中出血时间的归一化分析；（J）血小板输注对普拉格雷处理小鼠出血时间的影响；（K）J中出血时间的归一化分析；（L）氯吡格雷处理后2.5小时给予SiO₂-Mal纳米阱的小鼠出血时间；（M）氯吡格雷处理后0.5小时或5分钟给予SiO₂-Mal的出血时间归一化分析；（N）普拉格雷处理后2.5小时给予SiO₂-Mal纳米阱的小鼠出血时间；（O）普拉格雷处理后0.5小时或5分钟给予SiO₂-Mal的出血时间归一化分析

（5）SiO₂-Mal纳米阱在小鼠肝损伤模型中对氯吡格雷或普拉格雷的体内功能逆转

在肝损伤出血模型中，SiO₂-Mal纳米阱显著减少了接受氯吡格雷或普拉格雷治疗小鼠的出血时间和失血量，表明其能有效逆转抗血小板药物的活性并促进止血（图6A-D）；在抗血小板活性完全确立后，注射SiO₂-Mal纳米阱0.5小时内即可显著减少出血时间和失血量，证明其快速起效（图6E-H）；在新西兰大白兔模型中，SiO₂-Mal纳米阱同样显著减少了氯吡格雷治疗导致的出血时间和失血量（图6I-L）；进一步在巴马小型猪模型中，该纳米阱也显著减少了氯吡格雷导致的出血时间和失血量（图6M-P），证实了其在不同动物模型中对氯吡格雷的体内逆转作用。

图6 SiO₂-Mal纳米阱在不同动物肝损伤模型中对氯吡格雷/普拉格雷的体内功能逆转。（A-B）小鼠的出血时间（A）和失血量（B）（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，n=5）；（C-D）小鼠的出血时间（C）和失血量（D）（盐水、普拉格雷、普拉格雷+SiO₂-Mal组，n=5）；（E-F）小鼠肝损伤模型的出血时间（E）和失血量（F）（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，注射后2.5小时，n=5）；（G-H）小鼠肝损伤模型的出血时间（G）和失血量（H）（盐水、普拉格雷、普拉格雷+SiO₂-Mal组，注射后2.5小时，n=5）；（I）兔肝损伤出血模型示意图；（J）兔肝损伤模型抽血滤纸的代表性图像；（K-L）兔子的出血时间（K）和失血量（L）（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，n=5）；（M）猪肝损伤出血模型示意图；（N）猪肝损伤模型抽血滤纸和纱布的代表性图像；（O-P）巴马小型猪的出血时间（O）和失血量（P）（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组）

（6）在小鼠尾部出血和肝损伤模型中，SiO₂-Mal纳米陷阱长期治疗对氯吡格雷或普拉格雷的体内功能逆转

在长期接受抗血小板药物治疗的小鼠模型中，连续五天给予氯吡格雷或普拉格雷后，尾部出血时间显著延长，表明药物导致持续的血小板抑制（图7A-E）。然而，SiO₂-Mal纳米阱显著缩短了这种延长的出血时间，证明其能有效逆转长期抗血小板药物的作用，而血小板输注的逆转效果有限（图7A-E）。在肝损伤模型中，长期使用氯吡格雷或普拉格雷的小鼠表现出显著增加的失血量和出血时间，而SiO₂-Mal纳米阱的注射显著减少了这些指标，表明其能有效逆转长期抗血小板治疗的效应（图7F-I）。此外，通过测量血小板中的cAMP和P-选择素水平，发现氯吡格雷治疗导致cAMP水平升高和P-选择素水平降低，而SiO₂-Mal纳米阱治疗则降低了cAMP水平并提高了P-选择素水平，表明其恢复了血小板的生理功能（图7J-M）。

图7 SiO₂-Mal纳米阱对长期抗血小板治疗的体内逆转作用。（A）长期抗血小板药物处理的小鼠尾部出血模型示意图；（B）不同处理组小鼠的尾部出血时间（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+PLT、氯吡格雷+SiO₂-Mal组）；（C）不同处理组小鼠的尾部出血时间（盐水、普拉格雷、普拉格雷+PLT、普拉格雷+SiO₂-Mal组）；（D）B中氯吡格雷处理后出血时间的归一化分析（n=6）；（E）C中普拉格雷处理后出血时间的归一化分析（n=6）；（F-G）不同处理组小鼠肝损伤的出血时间（F）和失血量（G）（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，n=5）；（H-I）不同处理组小鼠肝损伤的出血时间（H）和失血量（I）（盐水、普拉格雷、普拉格雷+SiO₂-Mal组，n=5）；（J）通过ELISA检测不同处理组小鼠血浆中的cAMP水平（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，n=4）；（K）通过ELISA检测不同处理组小鼠血浆中的P-选择素水平（盐水、氯吡格雷、氯吡格雷+SiO₂-Mal组，n=3）；（L）通过ELISA检测不同处理组小鼠血浆中的cAMP水平（盐水、普拉格雷、普拉格雷+SiO₂-Mal组，n=4）；（M）通过ELISA检测不同处理组小鼠血浆中的P-选择素水平（盐水、普拉格雷、普拉格雷+SiO₂-Mal组）

（7）SiO₂-Mal纳米陷阱的生物安全性

在评估SiO₂ - Mal纳米阱的潜在临床应用时，研究发现即使在500 µg/mL的高浓度下孵育72小时，该纳米阱对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）也无明显细胞毒性（图8A）。此外，在1小时内不同浓度的SiO₂ - Mal纳米阱对红细胞的影响测试中，几乎没有观察到溶血现象（图8B）。体内副作用评估显示，与生理盐水处理组相比，SiO₂ - Mal纳米阱处理组在活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）水平等凝血系统参数上无显著差异（图8C-F），表明其不会影响凝血系统。同时，SiO₂ - Mal纳米阱处理也未导致白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等肝肾功能指标发生显著变化（图8G-L）。此外，对15天内四次接受SiO₂ - Mal纳米阱处理的小鼠的主要器官进行苏木精和伊红（H&E）染色，结果表明该纳米阱对心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要器官无不良影响（图8M）。对新西兰兔和巴马猪的进一步生物安全性评估也显示，SiO₂ - Mal纳米阱处理组与生理盐水处理组之间在血液凝固指数、血液生化指标以及主要器官的H&E染色结果上无明显差异（图S18-S22），表明SiO₂ - Mal纳米阱在体内具有良好的生物安全性。

图8 SiO₂-Mal纳米阱的安全性评估。（A）用所示浓度（以µg/mL为单位）的SiO₂-Mal纳米阱处理的HUVEC的细胞活力；n=4。（B）用所示浓度（以µg/mL为单位）的SiO₂-Mal纳米阱处理的红细胞的溶血率，分别以PBS和水作为阴性和阳性对照；n=5。（C-F）用SiO₂-Mal纳米阱或盐水处理的小鼠血浆样本的血液凝固参数，包括APTT（C）、FIB（D）、PT（E）和TT（F）；n=3。（G-L）用SiO₂-Mal纳米阱或生理盐水治疗的小鼠血清样本的血液生化分析，包括肝功能指标（ALB（G）、ALP（H）、ALT（I）、AST（J））以及肾功能指标（BUN（K）和CREA（L））；n=5。（M）用SiO₂-Mal纳米阱或生理盐水治疗的小鼠主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）切片的H&E染色图像