针对上述问题，重庆医科大学附属口腔医院翟启明团队阐明了cGAS-STING通路的激活阻碍了PDLSCs的成骨分化能力。从机制上讲，证明了炎症不仅导致线粒体DNA（mtDNA）通过线粒体通透性转变孔（mPTP）通道释放到细胞质中，还抑制了cGAMP的外排和降解。这两种机制共同促成了cGAS-STING通路的过度激活，进而损害了PDLSCs的成骨分化能力。因此，该团队制造了一种载有环孢素A（CsA，一种mPTP抑制剂）、ABCC1激动剂噻氟哌啶（TT）和ENPP1的线性聚乙烯醇聚（癸二酸甘油酯）（PEGA）水凝胶系统（CsA-TT-ENPP1@PEGA），该系统可以局部注射到牙周组织中。该三功能水凝胶系统在炎症条件下有效降低了PDLSCs中的cGAMP水平，并显示出作为治疗牙周骨缺损的有效治疗方法的显著前景，同时具有通过干预cGAMP稳态管理其他疾病的潜在意义。该文章于2025年2月13日以《cGAMP-targeting injectable hydrogel system promotes periodontal restoration by alleviating cGAS-STING pathway activation》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.02.010）。

研究示意图

(1) 炎症条件下PDLSC中cGAS-STING通路被激活

首先，研究人员进行了转录组分析以阐明牙周炎的机制。火山图显示，炎症条件下许多基因被上调（见图2a）。KEGG通路富集分析（图2b）、基因本体（GO）富集分析（图2c）和基因集富集分析（GSEA）（图2d）表明，LPS暴露增加了细胞质DNA感知通路、1型干扰素信号通路以及与cGAS-STING通路相关的干扰素相关免疫反应。随后，研究人员探究了cGAS-STING通路是否在炎症诱导的PDLSCs中被激活。免疫荧光染色确认LPS刺激促进了STING的表达（图2e和f）。WB分析也显示，H-PDLSCs + LPS组中cGAS-STING通路相关蛋白的表达增加（图2g）。在结扎诱导的牙周炎小鼠中，标记为CD90的PDLSCs中STING的表达也升高（图2h和i）。综上所述，这些结果表明，cGAS-STING通路在炎症诱导的PDLSCs中被激活。

图1（a）H-PDLSC和H-PDLSC+LPS中基因表达的火山图；（b）LPS处理后的KEGG通路富集分析；（c）GO富集分析；（d）GSEA分析；（e）H-PDLSC和H-PDLSC+LPS中STING的免疫荧光染色和定量分析（f）；（g）cGAS-STING通路相关蛋白的Western blot分析；（h）牙周组织中PDLSCs（CD90，绿色）和STING（红色）的免疫荧光染色；（i）对（h）中STING表达的定量分析

（2）抑制cGAS-STING通路促进PDLSCs成骨分化和牙周修复

为了验证cGAS-STING通路在PDLSCs功能失调中的作用，研究人员通过小干扰RNA（siRNA）敲低STING的表达。如预期，敲低STING显著改善了炎症条件下PDLSCs的分化能力（见图3a）。此外，他们还使用STING敲除（STING−/−）小鼠检测STING抑制对牙周修复的影响（见图3b）。免疫荧光染色显示，STING缺失显著减少了结扎诱导的牙周炎小鼠中CD90标记的PDLSCs中IRF3的表达（见图3c）。微型计算机断层扫描（micro-CT）结果表明，STING−/−小鼠中牙槽骨吸收显著减轻（见图3d），CEJ-ABC距离减小，BV/TV比值增加，骨小梁数量（Tb.N）增加（见图3e）。此外，还使用了STING的强效选择性拮抗剂H151来评估STING抑制对PDLSCs成骨分化的影响。结果发现，H151显著降低了STING及其下游通路蛋白的表达（见图3f），并显著缓解了炎症条件下PDLSCs的成骨分化缺陷（见图3g和图S4b）。为了进一步探讨STING药物抑制剂在牙周修复中的作用研究人员在牙周炎诱导一周后，向小鼠第二磨牙周围的六个部位注射C176（见图3h）。结果显示，C176显著减轻了牙周炎小鼠的牙槽骨丧失（见图3i和3j）。综上所述，体内外实验确认，cGAS-STING通路的激活与牙周炎密切相关，抑制STING具有治疗牙周炎的巨大潜力。

图2（a）siRNA介导的STING敲低改善了H-PDLSC+LPS细胞的成骨分化；（b）STING⁻/⁻小鼠治疗的示意图；（c）不同处理组小鼠牙周组织中PDLSCs（CD90，绿色）和IRF3（红色）的免疫荧光染色；（d）小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT图像；（e）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.N的定量分析；（f）H151处理后cGAS-STING通路相关蛋白的Western blot分析；（g）H151处理后阿利新红染色和矿化结节的定量分析；（h）C176处理C57小鼠结扎诱导的牙周炎的示意图；（i）不同处理组小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT图像和H&E染色；（j）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.Tb的定量分析

（3）从受损线粒体释放的mtDNA负责炎症后PDLSC中cGAS-STING通路的激活

为研究线粒体功能，使用Seahorse Bioscience XF分析仪检测了氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），作为代谢活性的指标。结果显示，LPS显著损害了PDLSCs的氧气消耗（见图4a），表明在炎症条件下线粒体代谢从氧化磷酸化转向糖酵解。共聚焦显微镜图像显示，H-PDLSCs + LPS组的线粒体网络受损，线粒体数量增多且形态延长（见图4b和c）。此外，线粒体反应性氧种（mtROS）是线粒体功能的重要指示物，该研究发现H-PDLSCs + LPS组的mtROS水平显著升高（见图4d）。与细胞内mtROS水平一致，H-PDLSCs + LPS组抗氧化基因的表达也显著低于H-PDLSCs组，并伴随着炎症条件下PDLSCs中膜电位（MMP）降低（见图4e）。8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）作为DNA氧化损伤的标志物，在H-PDLSCs + LPS组中高表达（见图4f）。此外，H-PDLSCs + LPS组中双链DNA和线粒体的共定位减少（见图4g和h），qRT-PCR进一步提示炎症条件下更多的mtDNA被释放到细胞质中（见图4i）。为了进一步明确cGAS-STING通路的激活与PDLSCs功能失调是否与mtDNA泄漏相关，使用溴化乙锭（EtBr）去除PDLSCs的mtDNA。EtBr显著减少了mtDNA拷贝数（，并抑制了H-PDLSCs + LPS组中cGAS-STING通路的激活（见图4j）。更重要的是，EtBr处理部分缓解了炎症微环境下PDLSCs的成骨分化缺陷（见图4k）。这些结果表明，炎症刺激引起的mtDNA损伤和释放到细胞质中，进一步激活了cGAS-STING通路，导致PDLSCs功能失调。

图3（a）使用Seahorse XFe24分析仪测量的线粒体呼吸能力分析（氧气消耗率；OCR）；（b）用Mito Tracker染色的线粒体代表性图像；（c）线粒体形态（每个细胞的分支长度和数量）分析；（d）MitoSox染色的免疫荧光和定量分析；（e）线粒体膜电位（▵Ψm，TMRM染色）的免疫荧光和定量分析；（f）8-OHdG染色的免疫荧光和定量分析；（g）线粒体（Mito Tracker，红色）和DNA（抗双链DNA抗体，绿色）的免疫荧光染色；（h）（g）数据的共定位分析；（i）通过qRT-PCR分析细胞质DNA的来源；（j）mtDNA耗竭后cGAS-STING通路相关蛋白的Western blot分析；（k）阿利新红染色和矿化结节的定量分析

（4）发生炎症时PDLSC中mtDNA通过mPTP通道释放到胞质溶胶中

研究发现，LPS刺激未显著增加PDLSCs的凋亡或BAX表达（见图5a和b），但mPTP相关蛋白HK2和VDAC的表达显著增加（见图5b），表明炎症可能改变了mPTP状态。LPS还导致线粒体肿胀、延长，并增加内质网与线粒体的膜接触（见图5c）。同时，Ca²⁺过载和基质颗粒的出现（见图5c，绿色箭头）表明线粒体功能受损。Rhod-2 AM染色显示，H-PDLSCs + LPS组的Ca²⁺水平显著升高（见图5d），且Calcein-CoCl₂染色结果表明mPTP开放增加（见图5e）。

RU360有效阻断了Ca²⁺的进入并抑制了mPTP的开放。此外，CsA抑制mPTP开放，减缓了cGAS-STING通路的激活（见图5f），并改善了PDLSCs在炎症条件下的成骨分化缺陷（见图5g，图S10）。在结扎诱导的牙周炎小鼠中，CsA有效减少了牙槽骨丧失（见图5h）并显著改善了CEJ-ABC距离、BV/TV和Tb.Th（见图5i）。长期使用CsA未见明显组织病理变化。综上，炎症通过线粒体Ca²⁺过载引发mPTP开放和mtDNA泄漏，进而激活cGAS-STING通路。

图4（a）通过PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡；（b）BAX、VDAC和HK2表达的Western blot分析；（c）H-PDLSCs和H-PDLSCs+LPS的代表性透射电子显微镜（TEM）图像（黄色标记的结构表示线粒体，红色虚线框出的结构是内质网，绿色箭头指示基质颗粒）；（d）通过Rhodi-2 AM染色和流式细胞术定量分析线粒体Ca²⁺；（e）通过Calcein AM检测mPTP开放情况，并通过流式细胞术定量分析MFI；（f）CsA处理后cGAS-STING通路相关蛋白的Western blot分析；（g）阿利新红染色和矿化结节的定量分析；（h）不同处理组小鼠牙槽骨的代表性Macro-CT图像和H&E染色；（i）CEJ-ABC、BV/TV%和Th.Tb的定量分析

（5）PDLSC中cGAMP稳态失调导致cGAS-STING通路持续激活

cGAS与细胞质中的mtDNA结合后，催化形成cGAMP，激活先天免疫反应。使用cGAMP ELISA试剂盒测量LPS刺激下不同时间点的cGAMP浓度，发现H-PDLSCs + LPS组细胞外cGAMP浓度显著低于H-PDLSCs组，而细胞内cGAMP浓度显著升高（见图6a），表明cGAMP稳态失调。可能的原因是cGAMP的转运减少或细胞外降解减少，导致细胞内cGAMP积累，激活cGAS-STING通路。

LPS处理显著降低了ABCC1和ENPP1的表达（见图6b、6c和6e），提示这些机制可能导致cGAMP积累。为增强cGAMP外排，使用ABCC1激动剂TT（1 μg/mL）并发现其显著增加了细胞外cGAMP（见图6f）。进一步实验表明，1 μg/mL TT与0.1 μg/mL ENPP1的联合使用不仅抑制了cGAS-STING通路的激活（见图6h），还恢复了PDLSCs的成骨能力（见图6i）。这些结果表明，cGAMP稳态的失调导致STING信号持续激活，从而损害PDLSCs的功能。

图5（a）ELISA分析H-PDLSC和H-PDLSC+LPS组在不同时间点的细胞外和细胞内cGAMP水平；（b）通过qRT-PCR定量ABCC1 mRNA的表达；（c, d）ABCC1表达的Western blot分析；（e）通过qRT-PCR定量ENPP1 mRNA的表达；（f）ABCC1激动剂TT促进cGAMP的细胞外转运；（g）TT和ENPP1联合应用后细胞外cGAMP的检测；（h）TT和ENPP1联合应用后cGAS-STING通路的Western blot分析；（i）阿利新红（AR）染色和矿化结节的定量分析

（6）通过CsA-TT-ENPP1@PEGA水凝胶恢复cGAMP稳态抑制cGAS-STING途径并促进体内牙周恢复

根据对cGAMP稳态失调的研究，研究团队合成了药物载体水凝胶系统，调节cGAMP的生成、外排和降解以治疗牙周炎。研究人员通过混合PEGA粉末和光引发剂LAP，制备了光固化水凝胶（见图7a）。不同浓度的LAP对PEGA水凝胶的力学性质和微观结构无显著影响（见图7b、7c和7d），因此选择了0.07%的LAP浓度。PEGA水凝胶具有良好的注射性和成胶性，能够精确填充不规则的牙周缺损并在蓝光照射下迅速固化（见图7f，图S14）。红外光谱（FTIR）和拉曼光谱分析确认了PEGA水凝胶的典型特性（见图7g和7h）。水凝胶在PBS中膨胀并缓慢降解（见图7i），并以快速初期释放后，慢且均匀地释放药物（见图7j）。在结扎诱导的牙周炎小鼠中，CsA-TT-ENPP1@PEGA水凝胶显著促进了成骨，CEJ-ABC距离较短，BV/TV %和Tb.Th明显提高（见图7k、7l、7m）。免疫荧光显示STING和IRF3在PDLSCs中的表达减弱（见图7n、7o）。这些结果表明，局部递送cGAS-ABCC1-ENPP1能够缓解牙周炎并促进牙槽骨再生。总的来说，研究人员发现恢复cGAMP稳态在牙周炎治疗中具有重要作用，并具有巨大的治疗潜力。

图6（a）PEGA水凝胶合成的示意图；（b）PEGA水凝胶在5%应变下储能模量和损耗模量（G′和G′′）的变化；（c）在5%应变和6 rad/s条件下PEGA水凝胶储能模量和损耗模量（G′和G′′）的时间扫描变化；（d）PEG粉末和PEGA水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图像；（e）PEGA的能谱分析（EDS）光谱；（f）PEGA水凝胶在不同3D模式下的注射照片（体外）；（g）PEG粉末和PEGA水凝胶的傅里叶变换红外光谱（FTIR）；（h）PEG粉末和PEGA水凝胶的拉曼光谱；（i）PEGA水凝胶在PBS中的膨胀和降解曲线；（j）PEGA水凝胶中DOX的累积释放曲线；（k）不同处理组小鼠牙槽骨的代表性Micro-CT图像；（l）CEJ-ABC的定量分析；（m）BV/TV%和Th.Tb的定量分析；（n）不同处理组小鼠牙周组织中PDLSCs（CD90，绿色）和STING（红色）的免疫荧光染色；（o）CD90阳性细胞和STING阳性细胞的共定位分析