针对上述问题，华东师范大学徐志爱教授团队开发了一种基于双层微针（MN）系统的创新治疗策略，用于时空可控的蛋白质降解和联合治疗GBM。该系统外层包含酸敏感的PROTAC纳米颗粒，可在肿瘤酸性环境中特异性释放并降解溴结构域蛋白4（BRD4）；内层则包含自氧合的BSA-MnO₂纳米颗粒，用于持续释放氧气以缓解肿瘤缺氧并增强光动力疗法（PDT）的效果。通过近红外光激活光敏剂，产生单线态氧（¹O₂），进一步激活PROTAC并实现精准的肿瘤治疗（图1）。这种局部递药平台能够绕过血脑屏障，减少系统性毒性，同时通过联合光动力疗法和蛋白质降解策略，显著抑制GBM肿瘤生长，为脑肿瘤治疗提供了新的思路。相关研究在2025年3月3日以 “ Self-Oxygenating PROTAC Microneedle for Spatiotemporally-Confined Protein Degradation and Enhanced Glioblastoma Therapy ”为题发表于《Advanced materials》 （DOI: 10.1002/adma.202411869）上。

图1. 自氧合PROTAC微针平台用于原位蛋白质降解和增强GBM治疗

（1）酸光双激活PROTAC纳米粒子和自氧化BM纳米粒子的工程化

该研究开发了一种酸激活和光响应型的PROTAC纳米颗粒（PPT7 NPs），用于精准肿瘤靶向治疗。通过合成光响应型BRD4靶向PROTAC前药OT7，并验证其光响应能力（图2b、c）。PPT7 NPs在中性pH（7.4）下粒径约35 nm，呈球形且分布较窄（PDI < 0.2），在酸性环境（pH 6.0）下解离（图2d、e）。荧光实验表明，PPT7 NPs在pH 7.4时荧光微弱，而在pH ≤ 6.4时显著增强，模拟内质网酸性微环境（图2f、h）。此外，PPT7 NPs在酸性条件下显著增强光动力活性，1O₂生成量在pH 6.0时为pH 7.4时的5倍（图2g）。为解决肿瘤缺氧问题，研究开发了BSA包覆的二氧化锰纳米颗粒（BM NPs），增强II型光动力治疗（PDT）激活的PROTAC效果（图2i、j）。BM NPs在酸性条件下催化H₂O₂分解产生氧气，氧气生成量是中性条件的3.0倍，并显著增加1O₂和ARV771的释放量（图2l、m）。这些结果表明，PPT7 NPs和BM NPs在酸性条件下协同作用，有效增强肿瘤靶向治疗效果。

图2 酸和光双激活PROTAC纳米粒子和自氧合BM纳米粒子的工程设计。（a）¹O₂触发PROTAC前药激活的示意图；（b）HPLC确定的OC7和OT7激活度与激光辐照时间的关系；（c）HPLC定量ARV771从OT7释放的百分比与激光辐照时间的关系；（d）pH 7.4时PPT7 NPs的代表性DLS数据和TEM图像；（e）pH 6.0时PPT7 NPs的代表性DLS数据和TEM图像；（f）不同pH缓冲溶液中PPT7 NPs的荧光曲线；（g）与对照PTPT7 NPs相比，不同pH值下PPT7 NPs的酸激活光动力活性；（h）不同pH值下PPT7 NP悬浮液的酸激活荧光图像；（i）BM NPs制造示意图；（j）BM NPs的X射线光电子能谱；（k）pH值为7.4或6.5时，与H₂O₂混合的BM NP溶液中溶解的O₂量；（l）在不同光照射时间下通过HPLC定量测定PPT7 + BM组和PPT7组中OT₇的百分比；（m）在不同光照射时间下通过HPLC定量测定PPT7 NPs和PPT7 + BM NPs中ARV771的释放百分比

（2）PPT7 NPs的细胞摄取、酸触发激活及与BM NPs的协同作用

本研究通过实验验证了酸激活和光响应型PROTAC纳米颗粒（PPT7 NPs）在胶质瘤细胞系U87-MG中的摄取、酸触发的细胞内激活能力以及与自供氧型BM纳米颗粒（BM NPs）的协同作用。流式细胞术（FCM）显示PPT7 NPs在3小时孵育时具有显著的细胞摄取能力（图3a）。共聚焦显微镜（CLSM）成像表明PPT7 NPs与内吞囊泡共定位良好，而酸不敏感的PTPT7 NPs未观察到荧光信号，证实了PPT7 NPs的酸触发解离和荧光激活依赖于细胞内酸性环境（图3b）。在酸性细胞内环境中，PPT7 NPs恢复光活性，并在671 nm激光照射下增加单线态氧（1O₂）的生成，触发ARV771的释放用于BRD4降解（图3c）。BM NPs通过增加氧气生成显著增强了PPT7 NPs的1O₂生成效率，提高了光动力治疗（PDT）效果（图3d）。在缺氧条件下，PPT7 NPs的光诱导BRD4降解能力得到验证，且BM NPs进一步增强了这一效果（图3e）。PPT7 NPs与激光照射的组合显著激活了caspase-3蛋白，诱导细胞凋亡，而BM NPs的加入进一步增强了这种激活（图3f）。细胞实验表明，PPT7 NPs在光照下显著抑制了U87-MG细胞的增殖，而PTPT7 NPs无明显细胞毒性（图3g）。BM NPs与PPT7 NPs联合使用时，通过缓解缺氧进一步增强了细胞毒性，降低了半抑制浓度（IC₅₀）（图3h）。这些结果表明，PPT7 NPs具有酸和光双重激活特性，能够实现时空可控的蛋白降解和抗肿瘤效果，而BM NPs通过增强氧气供应显著提升了PDT和BRD4降解的协同治疗效果。

图3 双激活PROTAC纳米粒子在体外显示出增强的细胞摄取和靶向的BRD4降解特征。（a）CLSM检查孵育12小时后PPT7 NPs的细胞内分布；（b）U87-MG细胞对酸敏感的PPT7 NPs的摄取以及酸激活后的PDT激活示意图；（c）CLSM检查激光照射PPT7 NPs产生的¹O₂以及与BM NPs共孵育时产生的更多¹O₂；（d）FCM检测不同组的¹O₂生成百分比；对PPT7和BM NPs的组合进行蛋白质印迹分析，激光照射诱导U87-MG细胞中的（e）BRD4降解和（f）caspase-3活化；（g）激光照射后的PPT7 NPs可有效抑制U87-MG细胞的增殖；（h）BM NPs增强了PPT7 NPs对U87-MG细胞的细胞毒性

（3）自供氧型PROTAC微针（SOP MN）的设计与功能验证

研究人员针对血脑屏障（BBB）在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中的挑战，设计了一种双层、可降解调节的自供氧型PROTAC微针（SOP MN），用于区域限制性递送PPT7 NPs和BM NPs以治疗GBM（图4a）。研究中使用透明质酸（HA）作为外层材料，实现PPT7 NPs的快速释放，以促进其在肿瘤细胞内的酸性激活；内层则采用HA的甲基丙烯酰化衍生物（HAMA），用于持续释放BM NPs作为“供氧站”。SOP MN具有规则的圆锥形结构，高度为800 µm，直径为300 µm，针尖宽度约为10 µm，足以穿透皮肤和软脑组织（图4b-d）。其机械性能测试显示，单层HA微针具有良好的机械强度（每针约1.18 N），足以穿透脑组织（图4e）。通过H&E染色进一步验证了SOP MN的穿透能力（图4f）。为了研究PPT7 NPs和BM NPs在SOP MN内的分布，研究者在外层HA中加载绿色荧光染料DiO，在内层HAMA中加载红色荧光染料DiI，结果显示两种纳米颗粒在微针中分层分布（图4g）。此外，通过检测PPa和5-氨基荧光素（5-AF）的荧光强度，验证了SOP MN的双层设计能够调节药物释放：外层HA微针在5分钟内快速释放80%的PDPA@PPa NPs，而内层HAMA微针则在12小时内缓慢释放约40%的BM-5-AF NPs（图4h）。体内实验进一步证实了SOP MN的分层释放特性：外层在5分钟内快速释放PPT7 NPs，内层则在6小时内持续释放BM NPs（图4i）。这种设计实现了PPT7 NPs的快速酸性激活和BM NPs的持续供氧，为GBM治疗提供了一种高效的局部递送策略。

图4 设计自氧合PROTAC微针以实现PROTAC纳米粒子和BM纳米粒子的差异释放。（a）SOP MN示意图，包括嵌入PPT7 NPs的外层、包含BM NPs的内层和空白基底；（b）SOP MN的光学显微镜图像；（c，d）SOP MN的SEM图像；（e）SOP MN、单层HA MN和单层HAMA MN的机械性能；（f）用SOP MN刺穿皮肤的H&E染色；（g）外层装载DiO、内核装载DiI的SOP MN的代表性共聚焦图像；（h）SOP MN（外层为PDPA@PPa、内核为BM-5-AF）、PDPA@PPa HA MN和BM-5-AF HAMA MN在PBS溶液中的体外释放曲线；（i）进行统计分析；（j）肿瘤成像显示MN应用后5分钟和6小时PPT7 NPs和BM NPs的释放存在差异

（4）SOP MN的体内治疗效果及机制研究

研究人员通过皮下GBM肿瘤模型评估了自供氧型PROTAC微针（SOP MN）的体内治疗效果。实验中，通过切除覆盖肿瘤的皮肤后植入微针并缝合伤口（图5a, b），SOP MN直接作用于肿瘤部位，实现区域限制性药物控释。肿瘤仅接受一次671 nm激光照射，随后监测肿瘤生长12天。结果显示，激光照射的PPT7 MN组（PPT7 MNL）抑制肿瘤生长约60%，而SOP MN联合激光组（SOP MNL）的肿瘤抑制率高达86%，且生存时间最长（图5c-e, f），表明BM NPs显著增强了PROTAC和PDT的联合治疗效果。H&E染色显示PPT7 MNL组和SOP MNL组的肿瘤细胞凋亡程度显著高于其他组（图5h），免疫组化（IHC）分析进一步表明PPT7 MNL组显著降低了BRD4蛋白水平（降低4.0倍），并增加了裂解型caspase-3的表达（增加4.3倍）（图5i, j, l, m），这一结果通过Western blot进一步验证（图5o）。此外，SOP MNL组相比PPT7 MNL组进一步降低了BRD4水平（降低2.8倍），并增加了裂解型caspase-3的表达（图5i, j, l, m），表明BM NPs通过缓解缺氧显著增强了PDT效果，并促进了ARV771的释放以降解BRD4。缺氧诱导因子α（HIF-α）在PP + BM MNL组和SOP MNL组中显著降低（降低3.1倍和3.0倍）（图5k, n），这一结果通过Western blot进一步确认（图5p）。实验期间，小鼠体重无显著变化（图5g），且主要器官未观察到明显的组织病理学损伤，表明SOP MN在体内具有良好的生物安全性。

图5 自氧合PROTAC微针在体内消退皮下胶质母细胞瘤。（a）治疗方案；（b）SOP MN治疗肿瘤的手术植入示意图；（c）不同治疗组的U87-MG肿瘤的个体肿瘤生长曲线和（d）相对生长曲线，（c）的统计分析采用双侧非配对t检验；（e）在接受不同治疗后第12天从小鼠身上解剖的U87-MG肿瘤照片；（f）实验期间荷瘤小鼠的生存曲线和（g）体重变化，（g）的统计分析采用单因素方差分析和Brown-Forsythe检验；（h）治疗后12天对肿瘤切片进行H&E染色；IHC分析肿瘤组织中的（i）BRD4、（j）cleaved-caspase-3和（k）HIF-α表达；IHC半定量分析肿瘤切片中的（l）BRD4、（m）cleaved-caspase-3和（n）HIF-α表达，（l-n）的统计分析采用双侧非配对t检验；对肿瘤裂解物中的（o）BRD4、cleaved caspase-3表达和（p）HIF-α进行蛋白质印迹分析

（5）SOP MN在原位GBM模型中的区域限制性释药与抗肿瘤效果

为了进一步验证自供氧型PROTAC微针（SOP MN）的区域限制性药物释放性能和抗肿瘤效果，研究者利用原位胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型进行了实验。在植入U87-MG-Luc细胞后的第五天，小鼠头骨被手术暴露，SOP MN被精准插入肿瘤部位，以实现纳米颗粒在GBM区域的局部释放（图6a, b）。这种方法使PPT7 NPs和BM NPs能够绕过血脑屏障（BBB）。生物发光成像、半定量分析以及脑切片的H&E染色显示，SOP MN联合激光组（SOP MNL）显著减少了肿瘤体积，与PBS MN组相比差异显著（图6c-f），且两只小鼠的GBM肿瘤被完全消除。生存曲线表明，SOP MNL组显著延长了GBM荷瘤小鼠的生存时间（图6g）。机制分析显示，SOP MNL组的肿瘤细胞凋亡比例显著高于PBS MN组（图6j），且Western blot和免疫组化（IHC）分析表明，SOP MNL组在体内将BRD4降低了2.8倍，裂解型caspase-3的表达增加了3.8倍（图6i, k, m, n），表明PDT和BRD4降解通过激活裂解型caspase-3介导的凋亡抑制了肿瘤生长。此外，HIF-α表达量降低了3.7倍（图6l, n），表明BM NPs通过缓解肿瘤缺氧增强了PDT效果并促进了ARV771的释放。实验期间，小鼠体重变化不大（图6h），且SOP MNL组小鼠未表现出显著的行为异常，表明SOP MN具有良好的生物安全性。综上所述，SOP MN实现了纳米颗粒的时空限制性释放，绕过了BBB，并通过精准下调BRD4和上调裂解型caspase-3有效抑制了肿瘤生长，同时BM NPs的参与进一步增强了对原位脑肿瘤的治疗效果。

图6 自氧合PROTAC微针有效抑制体内原位胶质母细胞瘤生长。（a）治疗方案；（b）SOP MN手术植入用于原位治疗肿瘤的数码照片，SOP MN被植入肿瘤部位并在5分钟后取出；（c）用PBS和SOP MN L治疗的小鼠的生物发光成像；（d-f）通过体内生物发光成像分析不同治疗组的U87-MG肿瘤模型中荧光素酶活性的总通量量化，（d）的统计分析通过双侧非配对t检验进行；（g）生存曲线和（h）实验期间荷瘤小鼠的体重变化，（h）的统计分析采用双侧非配对t检验；（i）肿瘤裂解物中BRD4、HIF-α和活化caspase-3表达的Western blot分析；（j）治疗后12天的肿瘤切片的H&E染色；（k）BRD4、（l）HIF-α和（m）cleaved-caspase-3在肿瘤组织中的表达的IHC分析；（n）IHC肿瘤切片中BRD4、HIF-α和cleaved-caspase-3表达的半定量分析，（n）的统计分析采用双侧非配对t检验