针对上述问题，香港城市大学徐臣杰教授和香港浸会大学Dr. Ka Loon Allen CHEUNG聚焦于微针（MN）装置的设计优化，特别是微针尖端微观结构的改进。受木材木质部各向异性多孔结构启发，采用单向冷冻铸造技术开发了具有类似结构的各向异性多孔微针（APC-MNs）。通过调节聚合物浓度和冷冻温度，可精确控制孔径大小。这种微针能快速从尖端向基底吸收液体，用于泪液采样，且在干眼症和糖尿病大鼠模型中表现出色。同时，其从基底向尖端的快速吸收特性可实现无需设备的药物加载，包括小分子、脂质纳米颗粒和细胞。在黑色素瘤和胸膜间皮瘤小鼠模型中，通过APC-MNs递送的γδ T细胞展现了显著的抗肿瘤效果，为过继细胞治疗提供了新途径。该文章于2025年03月06日以《Microneedles with an anisotropic porous microstructure facilitate the transdermal delivery of small molecules, lipid nanoparticles, and T cells》为题发表于《Matter》（DOI：10.1016/j.matt.2025.102038）。

图1 具有各向异性多孔结构的 MN 示意图

（1）APC-MNs的各向异性多孔结构

本研究采用冰模板法制造出类似木材木质部结构的微针，与传统随机孔隙多孔微针不同。研究者在PDMS微针模具中填充预聚物溶液，通过单向冷冻铸造模拟木质部各向异性管道结构（图2A）。具体操作是将模具铝箔覆盖后置于冷却浴平台，铝箔朝下形成温度梯度，使冰晶定向生长（图2B）。后续经过冷冻凝胶化、冰晶融化和冷冻干燥，制成APC-MNs。同时，还制造了IPC-MNs、LH-MNs和SH-MNs作为对照。

通过SEM和冷冻切片成像观察微针内部结构。APC-MNs和IPC-MNs因先冷冻，冰晶生长较大，形成相互连通的多孔结构（图2C）；而LH-MNs因交联在冷冻前进行，冰晶生长受限，孔隙相对孤立。APC-MNs尖端横截面具有均匀多孔结构，而SH-MNs尖端实心（图2D）。APC-MNs纵截面光学图像显示均匀垂直对齐通道，SEM图像也证实其独特的各向异性多孔结构，且与IPC-MNs相比，对齐通道更清晰，表明冰晶在尖端孔洞中垂直生长。这主要是因为PDMS模具和聚合物前驱体的热导率相似。然而，当微针模具的热导率低于或高于聚合物前驱体时，冰晶会分别向尖端壁或尖端中心生长。

图2 APC-MN、IPC-MN、LH-MN 和 SH-MN 的结构特征。（A）木材（凤凰木）图像和代表性 SEM 图像，显示木材木质部组织的结构；（B）APC-MN 制造过程中温度梯度下冰晶生长的图示；（C）代表性 SEM 图像，展示 APC-MN、IPC-MN、LH-MN 和 SH-MN 的横截面视图；（D）APC-MN 的纵向和横向视图；（E）代表性荧光图像显示 Cy3 染色的 APC-MN、IPC-MN 和 LH-MN 的纵向视图

（2）APC-MN 孔径的调节

本研究采用冰模板法制造出类似木材木质部结构的微针，通过调节聚合物浓度和冷冻温度来控制孔径大小。实验中使用了不同浓度的聚合物（2.5 wt%、5 wt% 和 7.5 wt%）和不同的冷冻温度（-196°C、-80°C和-20°C），发现孔径随着聚合物浓度的增加而减小，随着冷冻温度的降低而减小。当液体从尖端向基底被吸收时，APC-MNs可以作为生物流体采样工具，其中APC7.5-MNs在液体提取方面表现最佳（图3A、3B、3C）。当液体从基底向尖端被吸收时，这些微针可用于药物加载和递送，且在-20°C下制备的APC-MNs更适合用于治疗剂的递送（图3D、3E、3F）。为了增强APC-MNs的机械性能，研究者在加载药物溶液后对APC-MNs进行冷冻处理，得到APC-冷冻微针（APC-cryoMNs），其展现出足够的压缩力以穿透皮肤（图3G、3H和图3I）。这些结果表明，APC-MNs在液体吸收方面表现出双向能力，适用于液体提取和药物加载。

图3 APC-MN 的体外表征。（A）示意图显示了 APC-MN 尖端的液体吸收情况；（B）染料 Cy3 溶液流过 APC7.5-MNs、IPC7.5-MNs、LH7.5-MNs 和 SH7.5-MNs，比例尺为 500 μm；（C）APC7.5-MNs、IPC7.5-MNs、LH7.5-MNs 和 SH7.5-MNs 的液体吸收率的量化；（D）示意图显示了药物从背衬中装入 APC-MN；（E）APC5-MN 和 IPC5-MN 尖端细胞渗透的代表性图像，包括 hMSC、3T3 细胞、C2C12 细胞、B16 细胞、DC 和 γδT 细胞，比例尺为 300 μm；（F）量化 APC5-MN 和 IPC5-MN 尖端的细胞穿透深度；（G）APC-cryoMN 制造过程；（H）带有手柄的脱模 APC-cryoMN 的形态；（I）cryoMN（纯低温介质）、APC2.5-cryoMN、APC5-cryoMN、APC7.5-cryoMN 以 0.5 mm/s 的速度进行压缩试验，虚线表示压缩力为 5.8 N，可以穿透皮层；（J）APC5-cryoMN 处理和未处理的猪皮肤的组织学 H&E 染色图像

（3）APC-MN 用于泪液生物标志物的提取和分析

本研究中，研究者验证了APC-MNs在液体提取和药物加载方面的潜力。在液体提取方面，APC5-MNs在液体吸收效率和FITC-葡聚糖回收率之间达到了平衡。研究者从APC5-MNs中提取了包括葡萄糖和干扰素-γ在内的泪液生物标志物，并与泪液试纸、人造纤维拭子和棉拭子的生物标志物回收率进行了比较。结果表明，除了棉拭子外，所有装置回收的葡萄糖量均接近100%（图4A）。在IFN-γ的回收中，只有APC-MNs实现了89.7% ± 13.8%的回收率，而其他工具仍有部分IFN-γ残留（图4B）。为了评估APC5-MNs用于眼部应用的安全性，研究者测试了其机械性能，并选择实心水凝胶微针（SH-MNs）作为对照组。在剪切力测试中，APC5-MNs所需的剪切力显著小于SH-MNs，表明APC5-MNs更柔软（图4C）。当APC5-MNs的上加载表面湿润时，其柔软度进一步增加。在压缩测试中，小于2毫牛（mN）的力就足以使湿润的APC5-MN尖端弯曲（图4D）。在相同的力下，APC5-MNs被按压在离体猪角膜上时，并未对角膜造成物理损伤，与未经处理的角膜相似，而SH-MNs则对角膜层造成了明显的损伤（图4E）。这些数据表明，APC5-MNs在泪液提取过程中对眼睛的风险显著降低。接下来，研究者使用APC5-MNs从干眼症和糖尿病大鼠模型中提取泪液（图4F）。结果显示，在3分钟内，APC5-MNs从大鼠中提取的泪液量比商业泪液试纸更多，且提取相同体积泪液的速度是泪液试纸的两倍（图4G）。此外，从APC5-MNs提取的泪液中检测到的IFN-γ含量高于商业泪液试纸提取的泪液（图4H）。当APC5-MNs用于从正常和糖尿病大鼠中收集泪液时，检测到的葡萄糖水平存在显著差异，糖尿病大鼠泪液中的葡萄糖含量显著高于正常大鼠（图4I）。这些结果表明，APC5-MNs能够比商业泪液试纸提取更多的泪液，并且保留更少的提取生物标志物。

图4 用于泪液提取和后续分析的 APC5-MN。（A）从棉签、人造丝拭子、市售撕条和 APC5-MN 中回收葡萄糖；（B）从棉签、人造丝拭子、市售撕条和 APC5-MN 中回收 IFN-γ；（C）具有湿式称重传感器表面的 SH-MN、APC-MN 的剪切试验；（D）具有湿式称重传感器表面的 SH-MN、APC-MN 的压缩试验；（E）用 APC-MN 和 SH-MN 在每针 0.05 N 的力下处理的小鼠眼的 H&E 染色图像；（F）大鼠泪液采样图；（G）用 APC-MN 和泪条从干眼症大鼠身上提取的泪液量；（H）用 APC-MN 提取的干眼症大鼠泪液和泪条中的 IFN-γ 水平；（I）用 APC-MN 从正常和糖尿病大鼠的眼睛中收集的泪液中的葡萄糖水平

（4）APC-MNs用于γδ T细胞加载

本研究中，研究者探索了在-20°C下制备的APC5-MNs在经皮递送γδ T细胞方面的应用潜力。通过将细胞悬液添加到APC5-MNs的基底上并进行冷冻处理，制备了加载γδ T细胞的APC5-冷冻微针（APC5-cryoMNs）。具体步骤包括将悬浮在冷冻介质中的γδ T细胞添加到APC5-MNs的基底上，冷冻介质配方为含有2.5%（体积比）DMSO和100 mM蔗糖的PBS。细胞悬液被吸收进APC5-MNs的尖端后，在装有APC5-MNs的PDMS模具的基底上额外添加含10 wt%透明质酸（HA）或10 wt%聚乙烯醇（PVA）的PBS溶液，以解决脱模问题（图5A）。经过在-80°C下冷冻24小时并脱模后，得到APC5-cryoMNs。当APC5-cryoMNs被置于PBS中时，微针尖端会立即从微针支架上脱离，其各向异性多孔结构清晰可见（图5B）。经过染色后可以观察到尖端内的γδ T细胞（图5C），这表明在APC5-cryoMNs融化后，γδ T细胞可以保留在尖端内。

研究者使用活/死细胞染色法比较了在两种冷冻配方中保存的γδ T细胞的活性。与传统的含有10% DMSO和90%胎牛血清（FBS）的冷冻配方相比，含有2.5% DMSO和100 mM蔗糖的PBS配方中的细胞活性较低（49.3% ± 0.8%），但这种配方解决了与FBS相关的潜在问题，并确保了冷冻微针的机械强度（图5D和5E）。测试结果显示，从APC5-cryoMNs中回收的细胞活性（48.4%）与在冷冻管中使用相同配方的细胞活性相似，表明APC-MNs对细胞活性没有负面影响（图5F）。此外，在液氮中冷冻保存1个月后，从APC-MNs中解冻的γδ T细胞中仍有98.8% ± 1.1%表达Vδ2 T细胞受体（TCR），与原代细胞相似（图5G）。

含有γδ T细胞的APC5-cryoMNs被储存在液氮（-196°C）中。取出并在室温下放置时，霜会立即形成，冰到水的相变在1分钟内发生。使用热成像记录了从-40°C到40°C的温度变化，发现当放置在支架上或贴在人手指上时，APC5-cryoMNs的尖端温度在短时间内迅速升高。为了尽量减少冰晶对加载细胞造成的损伤，应在温度低于-30°C时（即在29秒内）使用APC5-cryoMNs，这可以最大限度地减少细胞损伤并保持尖端的强度。

图5 载有γδT 细胞的APC-cryoMN 的表征。（A）APC-cryoMN 的形态，其 MN 尖端由含有 2.5% DMSO + 100 mM 蔗糖的 PBS 组成，其底部由含有 10 wt% PVA 的 PBS 组成；（B）APC-cryoMN 在 PBS 中解冻后呈现各向异性多孔结构；（C）解冻后分离的载细胞 APC-cryoMN 尖端；（D）在含有 10% (v/v) DMSO 和 90% (v/v) FBS 的低温培养基中冷冻保存的 γδT 细胞的活力；（E）在含有 2.5% (v/v) DMSO 和 100 mM 蔗糖的 PBS 的低温培养基中冷冻保存的 γδT 细胞的活力；（F）在 APC-cryoMN 中冷冻保存的 γδT 细胞的活力；（G）在液氮中储存 1 个月后从 APC-cryoMN 中回收的 Vδ2⁺ 细胞的百分比

（5）Vδ2 T细胞从皮肤向胸膜肿瘤的迁移测试

本研究测试了通过APC5-cryoMNs递送Vδ2 T细胞治疗胸膜肿瘤的效果，并与静脉注射进行了对比。在MSTO-luc荷瘤小鼠模型中，研究者在肿瘤注射后的第3天使用加载了Vδ2 T细胞的APC5-cryoMNs进行治疗，并设置PBS静脉注射和Vδ2 T细胞静脉注射作为对照组。结果发现，APC5-cryoMN处理组在皮肤中显示出与Vδ2 TCR信号对应的绿色荧光信号，表明Vδ2 T细胞能够进入皮肤（图6B）。进一步分析显示，在静脉注射组和APC5-cryoMN组中，注射后第1天在脾脏和肺中均检测到CD3⁺Vδ2⁺细胞，但APC5-cryoMN组在肺和肝脏中的CD3⁺Vδ2⁺细胞数量变化趋势与静脉注射组不同，且在肿瘤中，两组的CD3⁺Vδ2⁺细胞数量从第1天到第4天均增加（图6C）。这些结果表明，通过APC5-cryoMNs递送的Vδ2 T细胞能够从皮肤迁移到内脏器官肿瘤。

在治疗效果方面，研究者比较了通过静脉注射和APC5-cryoMNs递送Vδ2 T细胞的疗效。在第3天和/或第6天给予一剂或两剂Vδ2 T细胞后，通过检测肿瘤中荧光素酶活性的成像结果显示，单剂量的Vδ2 T细胞通过静脉注射或APC5-cryoMNs递送后，肿瘤生长分别减少了约16.4%和14.7%（图6D）。两剂Vδ2 T细胞通过静脉注射或APC5-cryoMNs递送后，肿瘤生长分别减少了约58.6%和62%，而PBS对照组未观察到类似的减少。此外，通过APC5-cryoMNs递送Vδ2 T细胞时，小鼠的生存期略有增加（2天）（图6E）。这些结果表明，通过皮肤递送的Vδ2 T细胞能够有效抑制内脏器官肿瘤的生长，且APC5-cryoMNs递送的疗效与全身递送Vδ2 T细胞治疗间皮瘤的效果相似。

图6 APC5-cryoMN 介导的递送增强间皮瘤小鼠的 γδT 细胞浸润。（A）APC5-cryoMN 应用于小鼠后部皮肤；（B）皮肤中 CD3⁺Vδ2⁺ 细胞的代表性免疫染色图像，比例尺为 200 μm；（C）流式细胞术分析脾脏、肺脏、肿瘤和肝脏中 CD3⁺Vδ2⁺ 细胞的频率；（D）通过比较不同治疗组中随时间推移的荧光素酶活性与 MSTO-luc 肿瘤注射后第 2 天的活性来测量肿瘤生长情况，每组包含 3-4 只小鼠；（E）Kaplan-Meier 图显示不同治疗组 MSTO-luc 小鼠随时间的生存情况