针对上述问题，空军军医大学焦凯、牛丽娜、Niu Wen研发出一种水凝胶，用于清除细胞外RNA并释放贝伐单抗，阻断骨软骨界面处的神经血管化，从而减轻TMJ（颞下颌关节）OA疼痛和疾病进展。这种水凝胶通过交联醛基-苯硼酸修饰的海藻酸钠/聚乙烯亚胺接枝的原儿茶酸（OSAP/PPCA）和贝伐单抗持续释放纳米颗粒（BGN@Be）形成，命名为OSPPB。动态的席夫碱键和苯硼酸酯键使其具有可注射性、自愈性和pH/活性氧种双重响应性。OSPPB水凝胶能够显著抑制体外的血管生成和神经生成。在体内OA模型中，关节腔内注射OSPPB加速髁突的愈合过程，并通过抑制骨软骨界面处的神经血管化来缓解慢性疼痛。这种可注射水凝胶代表了一种治疗OA及相关疼痛的有前景的技术。该文章于2025年2月6日以《Neurovascularization inhibiting dual responsive hydrogel for alleviating the progression of osteoarthritis》为题发表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-56727-8）。

图1. 可注射的、自愈的、pH/ROS双响应的聚阳离子水凝胶通过抑制骨软骨界面的神经血管形成逆转TMJOA并缓解慢性疼痛

(1) OSAP、PPCA和BGN@Be的制备和表征

OSP-PB水凝胶的制备过程如图2a所示。为构建OSP-PB水凝胶，研究者通过形成动态的硼酸酯键和席夫碱键，将醛基苯硼酸修饰的海藻酸钠（OSAP）与聚乙烯亚胺接枝的原儿茶酸（PPCA）分子骨架交联，同时通过配位相互作用加入BGN@Be。硼酸酯键是通过OSAP的硼酸基团与PPCA的儿茶酚基团交联形成的。同时，PPCA的氨基与OSAP的醛基交联形成席夫碱键。3-氨基苯硼酸被接枝到海藻酸钠上，得到SAP聚合物（图2a）。随后，使用二氧化钠氧化SAP的羟基，得到含有硼酸基团和醛基的OSAP聚合物。PPCA聚合物通过酰胺化反应合成，该反应涉及原儿茶酸的羧基与聚乙烯亚胺中的氨基结合（图2a）。

（2）OSPPB水凝胶的制备和表征

为了获得OSPPB水凝胶，将BGN@Be分散的OSAP溶液和PPCA溶液通过涡旋混合，水凝胶在3秒内形成，主要通过动态的硼酸酯键和席夫碱键（图2b）。ATR-FTIR光谱确认了水凝胶的化学结构，1431 cm-1的新峰值归因于硼酸酯键，1735 cm-1的特征峰消失表明醛基参与了席夫碱反应（图2c）。扫描电子显微镜和能谱分析显示，OSPP和OSPPB水凝胶均呈现均匀的多孔三维结构，约200 μm的微孔（图2d）。OSPPB水凝胶的表面具有BGN分散分布（图2d中的红色圆圈），元素分析确认了BGN@Be的加入（图2e）。动态的席夫碱键和硼酸酯键赋予OSPPB水凝胶可重塑性、可注射性、自愈性和pH/ROS双响应性。如图2b 1–2所示，水凝胶可通过26G针头注射并写出字母“J”。如图2b 3–6所示，水凝胶在37 °C下自愈，两个部分合并为一个整体，无断裂。流变测试显示，OSPPB水凝胶的G’（354.42 ± 3.97 Pa）明显高于OSPP水凝胶（129.46 ± 3.09 Pa），表明其更强的凝胶特性（图2f）。两种水凝胶均表现出非牛顿剪切变稀特性（图2g）。这些特性使水凝胶适用于关节内注射，且不影响其结构。

图2 OSPPB水凝胶的制备和表征。（a）OSPPB水凝胶的简易制备路线；（b）OSPPB水凝胶的凝胶化、可注射性和自愈特性；（c）PPCA、OSAP、OSPP和OSPPB的ATR-FTIR，显示了导致凝胶化的席夫碱键和苯硼酸酯键；（d）OSPP和OSPPB的SEM，显示了BGN@Be均匀分布在OSPPB水凝胶表面，红圈表示BGN，比例尺=200 μm（左）和5 μm（右）；（e）OSPPB水凝胶的SEM-EDS（BGN分布区域），显示了OSPPB水凝胶中的钙（Ca）、磷（P）和硅（Si）元素；（f）OSPP和OSPPB水凝胶的频率扫描和时间扫描序列，以及（g）剪切稀释测试，G'表示储能模量，G''表示损耗模量

（3）OSPPB水凝胶的pH/ROS双重响应性、抗氧化性和核酸清除特性

为了测试OSPPB水凝胶的pH/ROS双重响应性，研究者模拟了低pH（HCl）和高ROS（H₂O₂）环境（图3a-d）。低pH或高ROS刺激使水凝胶迅速崩解为液态，且在同时刺激下，水凝胶的G’降至17.133 Pa（图3b）。SEM显示，单独的ROS或pH刺激下孔隙可见，而在ROS + pH组合刺激下，孔隙崩塌，表明网络解体（图3c、d）。水凝胶在6天内完全解体（图3e），并实现了贝伐单抗的控制性释放（图3f）。席夫碱键和硼酸酯键的解离导致其pH/ROS双重响应性。抗氧化性能通过DPPH清除试验验证，低浓度提取物的清除率与维生素C相当（图3g）。虽然50 μg/mL组出现变色，但无法确定其原因，因此该实验仅定性确认了抗氧化特性。水凝胶的正电荷和核酸清除特性通过电荷分析和结合实验验证（图3h、i-k）。分子动力学模拟表明，PEI比VEGF更容易与RNA结合（图3l）。这一特性使水凝胶能捕捉骨关节炎中的外源RNA，抑制异常神经血管化。

图3 OSPPB水凝胶的pH/ROS双重响应性、降解性、抗氧化性能及正电性能。（a-d）图像、频率扫描和经PBS（pH = 5）和/或H₂O₂孵育后的OSPPB水凝胶的SEM（比例尺 = 200 μm）；（e）OSPP和OSPPB水凝胶在PBS中的降解；（f）S浓度变化的特征，持续14天；（g）OSPPB与DPPH共同培养30分钟后的照片及相应的统计结果；（h）OSPP和OSPPB水凝胶的zeta电位；（i-k）结合测试特征，显示OSPPB与RNA的结合；（l）分子动力学调节及其对RNA（浅蓝色）、VEGF（红色）和PEI（聚乙烯亚胺，紫色）的量化

（4）OSPPB水凝胶对体外神经血管形成的抑制作用

OSP-PB水凝胶通过体外实验测试了其对三叉神经节（TG）细胞和内皮祖细胞（EPCs）的影响。EPCs的LIVE-DEAD染色和CCK-8实验显示细胞活性未受影响。EPC迁移和管腔形成实验表明，OSP-PB水凝胶比PPCA和BGN@Be表现出更强的抑制作用（图4a，c，d）。TG细胞的形态和轴突生长实验显示，水凝胶处理显著减少了树突长度和细胞相互作用（图4b，e，f）。实验还表明，OSAP缺乏抑制作用，而PPCA和BGN@Be是主要的抑制成分。总体来看，OSP-PB水凝胶在体外有效抑制血管生成和神经生成。

图4 OSPPB水凝胶抑制血管生成和神经生成。（a，b）EPCs和TG细胞的代表性显微镜图像，显示了细胞迁移、管状形成和形态变化，处理24小时后的结果；（c，d）处理后EPCs迁移细胞数和迁移距离的定量结果；（e，f）处理后TG细胞相互作用和树突长度的定量结果

（5）OSPPB水凝胶对体内TMJOA进展的影响

研究者构建了单侧交叉咬合（UAC）小鼠模型，评估水凝胶对颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）的作用（图5a）。立体显微镜观察发现，OSPPB组未见新血管生成（图5b）。H&E和萨法兰O/绿色染色结果显示，OSPPB处理组髁突愈合效果较好，OARSI评分低，软骨层厚，蛋白聚糖增多（图5c1、c2、d-g）。银染色显示神经纤维减少（图5c3、h）。微裂纹总长度在OSPPB组明显减少（图5c4、i）。三维重建显示，OSPPB组关节面光滑，无侵蚀（图5c5）。定量分析确认OSPPB增加了骨矿密度，塞来昔布效果较轻（图5j、k）。定量PCR结果证明OSPPB改变了骨关节炎髁突中的微环境（图5l）。

图5 OSPPB水凝胶可缓解小鼠的TMJOA。（a）简易制备路线，描述了设计和体内实验结果；（b）在关节注射后3周，显示对照组（CON）和实验组（单侧前交叉咬合，UAC）在髁突上的比较形态的示意性宏观视图；（c）H&E染色、SF染色、银染色、SEM（箭头指示微裂纹）和微CT的代表性图像；（d-k）OARSI评分和（c）中图像的半定量统计分析；（l）qRT-PCR分析髁突中神经血管因子（Vegf、Pdgfb、Ngf、Ntn1、Ntn3、Ntn4）基因表达

（6）水凝胶的成骨潜力评估

骨软骨界面（约50 μm厚）确保髁突软骨与下软骨-骨的平滑过渡，但在骨关节炎（OA）中发生显著变化。研究者通过原子力显微镜和扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）检查了其重塑（图6）。结果显示，控制组髁突的杨氏模量逐渐增加，而UAC组的模量不规则增大（达到17.04 MPa），OSPPB治疗后恢复正常，塞来昔布组未恢复（图6a）。UAC组和UAC + 塞来昔布组的Ca和P分布扩展到软骨，而OSPPB组显示与控制组相似的分布（图6b）。总之，OSPPB水凝胶能缓解TMJOA引起的微结构和微机械变化。

图6 OSPPB水凝胶改善了TMJOA引起的骨软骨界面的变化。（a）AFM表征TMJ骨软骨界面的机械性质，分析了在CON和UAC组不同处理后3周的骨软骨界面的力学特性；（b）骨软骨界面的SEM-EDS显微图

（7）OSPPB水凝胶对体内骨关节炎疼痛的影响

通过组织学和微结构表征，确认了OSPPB对TMJOA的修复作用，但其是否缓解疼痛仍未明确。由于无法直接测量小鼠疼痛，通过“类似疼痛的行为”进行测试。EPM和OFT结果显示，塞来昔布和OSPPB水凝胶缓解了类似焦虑的行为（图7a，b）。机械性痛觉过敏测试显示，塞来昔布和OSPPB水凝胶治疗后撤回阈值恢复正常（图7i）。脑电图结果也显示治疗后低频谱能量降低，类似控制组（图7j）。这些结果表明，塞来昔布和OSPPB水凝胶显著缓解了面部疼痛。

图7 塞来昔布和OSPPB水凝胶表现出显著的缓解疼痛功能。（a）CON组和UAC组小鼠在EPM测试中的代表性轨迹，以及相应的统计结果（c-e）；（b）OFT中小鼠的代表性轨迹，以及相应的统计结果（f-h）；（i）von Frey测试结果显示不同处理后的镇痛效果；（j）小刷子刺激前后的EEG频谱图

（8）OSPPB水凝胶可有效减弱骨软骨界面的神经血管形成

为了进一步验证疼痛缓解相关的解剖变化，进行了SYTO RNASelect绿荧光染料和E-cadherin共染色实验，用于识别骨软骨界面的外源性RNA（exRNA）。图8a、d显示，OSPPB水凝胶处理后exRNA减少，而Celecoxib无明显变化。前向追踪显示，UAC + OSPPB组三叉神经节衍生轴突末端分布减少（图8b、e）。免疫共聚焦显微镜下，PGP 9.5和CGRP结果一致（图8b、f、g）。与UAC + Celecoxib组相比，OSPPB水凝胶处理后PECAM1阳性血管和VEGF水平降低（图8c、h）。此外，环氧合酶2、DCC和物质P等疼痛介质在OSPPB水凝胶处理后减少（图8c、i-k）。总的来说，Celecoxib在缓解疼痛方面有效，但对再生微环境的影响有限，而OSPPB水凝胶则有效缓解骨关节炎疼痛。

图8 OSPPB水凝胶有效减弱了骨软骨界面处的神经血管化。（a）CON组和UAC组在不同处理后的3周，髁突骨软骨界面上exRNA分布的代表性图像；（b）三叉神经节前向追踪及神经（PGP9.5和CGRP）、血管（CD31）和VEGF的免疫荧光染色的代表性图像；（c）痛觉相关因子（COX2、DCC和SP）分布的代表性图像；（d）（a）的半定量统计分析；（e-h）（b）的半定量统计分析；（i-k）（c）的半定量统计分析