膀胱癌，尤其是非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），在老年人群中发病率较高。传统治疗方法（如手术切除、膀胱镜辅助光疗和高剂量放射治疗）虽然有效，但患者仍面临较高的复发和进展风险，并需长期随访。自1990年代以来，膀胱癌的5年生存率提升有限，显示出治疗效果仍有待提升。传统技术难以在诊断、治疗和随访之间实现实时性、同步性和长效性。近年来，免疫疗法的出现为膀胱癌治疗带来了新的希望，但仍需要进一步开发非侵入、全流程影像导航的高效治疗手段，以更好地应对NMIBC的治疗挑战。

针对上述问题，苏州大学的刘庄教授团队开发了一种基于X射线激活纳米转换器的非侵入式全程实时NIR-II影像导航按需分段光动力疗法（f-PDT），用于自发性NMIBC小鼠模型的治疗。通过纳米闪烁体吸收、分布并转换X射线能量，该方法产生可见光辐射用于高效PDT，同时在生物透明窗口下实现NIR-II荧光成像。在纳米转换器上修饰肿瘤血管生成特异性肽，确保其在复杂亚型的自发性NMIBC中实现特异性靶向和充分富集。结果表明，该方法显著增强了肿瘤缩小效果，抑制复发，提高小鼠生存率，并实现了基于NIR-II影像的全程预后监测。性能评估采用自制设备量化NIR-II荧光信噪比，验证了从诊断到预后、按需定制辐射剂量的全程监测功能。该研究提出了一种整合诊断、治疗和长效监测的NMIBC治疗新策略，为提高NMIBC的治疗效果和预后提供了有力支持。相关研究在2024年9月19日以“Full-course NIR-II imaging-navigated fractionated photodynamic therapy of bladder tumours with X-ray-activated nanotransducers”为题发表于《Nature Communications》 （DOI：10.1038/s41467-024-52607-9）上。

（1）双激活纳米转换器用于X射线激活的PDT和NIR-II成像

本研究开发了具有双激活功能的核壳结构镧系掺杂纳米闪烁体（Ln-NSs），用于增强光动力疗法（PDT）和NIR-II成像。通过在NaGdF₄基质中引入Tb³⁺和Nd³⁺作为双激活剂以及Ce³⁺作为能量介导剂，并在外层包覆NaLuF₄以提高X射线吸收效果，这种纳米转换器实现了X射线激活的可见光和NIR-II荧光发射（图1a）。透射电子显微镜（TEM）图像（图1b）显示，这些球形纳米颗粒呈现均匀的六角形形貌，具有强烈的绿色（490、546、585、620 nm）和NIR-II（865、895、1060、1340 nm）荧光发射（图1c），归因于Ce³⁺到Tb³⁺和Nd³⁺的高效能量转移（图1e–j）。为实现特异性靶向治疗，这些纳米转换器通过O-磷酸乙醇胺（AEP）进行表面修饰，并与光敏剂玫瑰苯胺（RB）共价连接（图1k–m）。由于Ln-NSs可见光发射与RB吸收光谱高度重叠，能量传递效率达99.1%（图1k、l），在X射线激活下能够生成强烈的¹O₂信号，用以支持分段光动力治疗（f-PDT）。表面功能化后的NSs-RB在808 nm激光和X射线激发下仍保持明显的1064 nm NIR-II荧光发射（图1n、o），展示出在体内成像和治疗的潜力，满足特定的临床需求。

图1. X 射线激活纳米闪烁体和纳米传感器。(a) 核-壳镧系掺杂纳米闪烁体的发光机制示意图，X射线激发绿色和NIR-II发射；(b) 24.6纳米 NaGdF4,Tb@NaGdF4@NaLuF4的TEM图像，插图为高分辨率TEM图像和傅里叶变换衍射图案；(c) NaGdF4,Tb@NaGdF4@NaLuF4的X射线激发光谱；(d) 808纳米激光激发光谱及NIR-II发射；(e) 在546纳米处监测的激发光谱；(f) 546纳米处的荧光衰减曲线；(g) NaGdF4,Tb和NaGdF4的标准化X射线激发光谱；(h) 1060纳米处的激发光谱；(i) 1060纳米处的荧光衰减曲线；(j) NaGdF4,Tb@NaGdF4和NaGdF4@NaGdF4的标准化X射线激发光谱；(k) 24.6纳米 NaGdF4,Tb@NaGdF4@NaLuF4的X射线激发可见光谱与RB吸收光谱；(l) NSs和NSs-RB的X射线激发可见光谱；(m) SOSG溶液在X射线辐照下的相对强度（n = 6）；(n) NSs-RB的X射线激发NIR-II光谱，插图为代表性照片和NIR-II荧光图像；(o) 808纳米激光激发下NSs-RB的NIR-II光谱，插图为代表性照片和NIR-II荧光图像。(m)数据以均值±SEM表示

     (2) 自体NMIBC小鼠模型中的特异性靶向与纳米转换器积累验证

为推进f-PDT成为临床适用技术，研究团队选择了由致癌物N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）诱导的C57BL/6雌性小鼠自体膀胱癌模型，以模拟人类膀胱癌的分子亚型差异（图2a）。经MNU处理后，代表性照片和苏木精-伊红染色（H&E）分析显示，NMIBC的病理特征明显（图2b），表明模型建立成功。为提高纳米转换器在自体肿瘤中的特异靶向和积累能力，研究人员在纳米转换器表面标记了肿瘤靶向的环状RGD肽（cRGD）和荧光素（FITC）（图2c）。FTIR光谱确认了表面修饰，并测得纳米转换器的稳定性和尺寸（图2d）。进一步验证特异性靶向效果，利用NIR-II荧光成像观察纳米转换器在NMIBC小鼠和健康小鼠膀胱中的积累（图2f）。与健康小鼠相比，cRGD标记的纳米转换器在NMIBC小鼠膀胱中产生的NIR-II荧光信号强度显著增强，说明cRGD标签实现了有效的靶向积累。采用人膀胱癌细胞系T24和253J，观察cRGD标记增强了纳米转换器的内吞效率（图2h–k）。在正常人尿路上皮细胞（SV-HUC-1）中，RB和FITC信号强度显著降低，进一步证实了cRGD标签的肿瘤靶向性。此外，流式细胞术和不同细胞类型的荧光信号分析进一步支持cRGD的高亲和性（图2l）

图2. F/cRGD标记纳米传感器的本土膀胱肿瘤特异性和增强的细胞摄取。(a) NMIBC小鼠模型建立及单次光动力治疗实验示意图；(b) MNU灌注后NMIBC小鼠膀胱的代表性照片及H&E染色，黑箭头指示癌瘤；(c) 通过F/cRGD肽对纳米转导器进行表面功能化；(d) NSs-AEP、NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD的动态光散射；(e) 它们的Zeta电位（n = 4）；(f) NSs-RB-F/cRGD处理的健康小鼠及NSs-RB-FITC和NSs-RB-F/cRGD处理的NMIBC小鼠膀胱的离体NIR-II荧光成像和冷冻切片（FITC通道）；(g) (f)中冷冻切片的FITC荧光信号定量分析（n = 6）；(h) T24细胞用50 μg mL⁻¹的NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理后的荧光成像；(i) RB（左）和FITC（右）荧光强度的定量分析（n = 10）；(j) 不同处理下T24细胞的NIR-II荧光图像；(k) NIR-II荧光信号强度的定量分析（n = 10）；(l) T24细胞经NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理后的流式细胞分析（n = 3）

(3) F/cRGD 标记纳米传感器的细胞毒性、放射增敏作用和 X 射线激活的光动力治疗

研究人员评估了纳米转换器对T24和253J细胞的细胞毒性及其在X射线激活下的PDT效果。细胞毒性实验显示，NSs-RB-F/cRGD及其各组分NSs-AEP和NSs-RB对T24、253J和SV-HUC-1细胞无显著毒性（图3a）。在X射线激活下，NSs-AEP + X射线、NSs-RB + X射线和NSs-RB-F/cRGD + X射线对T24细胞的活性明显下降，与辐射剂量（图3b）和纳米转换器浓度（图3c）呈正相关。NSs-RB-F/cRGD + X射线处理后的细胞存活率显著低于NSs-RB + X射线，表明F/cRGD标记增加了纳米转换器的细胞摄取。进一步的体外克隆形成实验（图3d）和γ-H2AX免疫荧光分析（图3e、f）证实了纳米闪烁体的增敏效应，通过高原子序数元素（如Gd、Ce、Tb、Nd和Lu）与X射线的强相互作用生成细胞毒性羟自由基（·OH）。通过ROS生成实验（图3g–j）观察到，NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD在X射线激活下有效产生1O₂和·OH。特别是NSs-RB-F/cRGD + X射线处理的细胞中观察到最强的ROS信号，表明其在PDT中的高效性和特异性靶向作用。这些结果表明，纳米转换器能够在X射线激活下进行PDT，通过F/cRGD标记进一步提升了其细胞内摄取和治疗效率。

图 3. 细胞毒性、放射增敏作用和 ROS 生成评估。(a) 不同浓度下NSs-AEP、NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理的T24细胞活力（n = 5）；(b) 在0、1、2和4 Gy X射线照射下RB、NSs-AEP、NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理的T24细胞活力（50 μg mL⁻¹，n = 5）；(c) 不同浓度和X射线剂量下NSs-RB-F/cRGD处理的T24细胞活力；(d) 各种X射线剂量下NSs-AEP、NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理的T24细胞存活分数（50 μg mL⁻¹）；(e) 在1 Gy辐照下NSs-AEP、NSs-RB和NSs-RB-F/cRGD处理的T24细胞的γ-H2AX免疫荧光图像；(f) γ-H2AX信号定量（n = 9）；(g) 在1 Gy辐照下不同处理的T24细胞的ROS荧光成像（DHE）；(h) ROS信号定量（n = 10）；(i) 1 Gy辐照下不同处理的T24细胞的¹O₂荧光成像（SOSG）；(j) ¹O₂信号定量（n = 10）

(4) 纳米转换器X射线激活PDT的细胞凋亡诱导机制

该团队通过Annexin V-APC/PI检测法评估了纳米转换器的X射线激活PDT对T24细胞的凋亡诱导效果。为揭示纳米转换器的协同PDT作用，采用了不引起显著细胞死亡的1 Gy低剂量X射线。结果显示，NSs-RB + X射线和NSs-RB-F/cRGD + X射线处理的T24细胞中观察到严重的细胞死亡现象（图4a，），流式细胞术分析结果显示，NSs-AEP + X射线处理的细胞凋亡率为29.41%，而NSs-RB + X射线和NSs-RB-F/cRGD + X射线处理的细胞凋亡率则分别达到44.37%和55.71%（图4b），证实了纳米转换器通过本征的放射增敏和增强的PDT实现了高效细胞凋亡诱导。进一步的蛋白质表达检测（图4c）显示，NSs-RB-F/cRGD + X射线显著增加了促凋亡蛋白Bax和Bad的表达，同时减少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，且观察到caspase-3切割活化水平的显著提高（图4d）。这些结果表明，NSs-AEP的放射增敏效应、RB的PDT功能以及cRGD标记的靶向积累共同作用，显著增强了X射线激活的PDT效果。此外，成像流式细胞仪（IFC）揭示了细胞结构的破坏情况（图4e）。相比对照组，NSs-RB-F/cRGD + X射线处理的T24细胞显示出细胞膜起皱、收缩及突起等特征，且FITC和RB信号随辐射剂量增加而降低，表明ROS（如¹O₂和·OH）引起的细胞损伤会经历细胞周期停滞和DNA修复等过程，最终导致细胞凋亡。这些结果证实了纳米转换器在X射线激活PDT中的协同凋亡诱导机制，为其临床应用提供了支持。

图 4 .细胞凋亡分析和体外X射线激活的PDT评估。(a) 不同处理下T24细胞的Annexin V-APC/PI双染检测（纳米转导器浓度：50 μg mL⁻¹）；(b) 1 Gy辐照下不同处理的T24细胞的流式细胞术凋亡分析（50 μg mL⁻¹）；(c) 1 Gy辐照下不同处理的T24细胞蛋白表达的Western blot分析；(d) Western blot对应的定量和统计分析（n = 3，样本来自同一实验，Western blot在三个平行实验中进行）；(e) 不同处理后孵育12小时的T24细胞成像流式细胞术结果和代表性图像（50 μg mL⁻¹）。(d)中的数据以均值±SEM表示，P值通过单因素ANOVA和多重比较检验计算

（5）单次分段光动力疗法（single-f-PDT）在自体膀胱癌小鼠模型中的抗肿瘤效果

研究人员在自体膀胱癌小鼠模型中评估了纳米转换器的抗肿瘤潜力，采用一次性X射线照射（single-f-PDT）对膀胱癌进行治疗（图5a）。在X射线（4或6 Gy）和纳米转换器（NSs-RB-F/cRGD）结合治疗下，小鼠的存活率显著提高，其中6 Gy处理组在21天内的存活率最高，达到86%（图5b, c）。与传统手术辅助PDT（5-ALA + 激光）相比，NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy显示出相似的疗效，但明显优于不含RB或cRGD的其他治疗组。HE和Ki-67染色分析进一步证实，接受NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy和5-ALA + 激光治疗的小鼠膀胱组织中未检测到肿瘤病理特征，表明治疗有效控制了NMIBC的进展（图5d）。为进一步揭示single-f-PDT的治疗机制，分析了小鼠膀胱中的免疫细胞浸润情况。免疫组化结果显示，NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy和5-ALA + 激光治疗组的细胞毒性T淋巴细胞（CD4和CD8细胞）增殖与健康小鼠相当，且显著高于未治疗的NMIBC小鼠（图5e–g）。同时，接受有效治疗的小鼠脾脏保持正常大小，并且在HE染色中显示了清晰的红髓和白髓区域（图5h, i）。进一步的免疫组化分析表明，NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy和5-ALA + 激光治疗有效恢复了免疫平衡，增强了抗肿瘤免疫反应（图5j–l），从而证实了非侵入性single-f-PDT对膀胱癌的显著治疗效果。

图5.非侵入性单次 f-PDT 导致的肿瘤消退。(a) 单次光动力治疗（single-f-PDT）实验方案示意图（每组n = 7只小鼠）；(b) 接受不同治疗的NMIBC小鼠在21天内的生存概率；(c) 第21天解剖存活小鼠的膀胱照片；(d) 各组膀胱的H&E染色代表图像，M为肌层，Ur为尿路上皮，Lp为固有层，黑箭头：NMIBC病灶，蓝箭头：MIBC；(e) CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像和定量分析（f和g），分别来自健康小鼠和接受PBS、5-ALA + 激光、NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy治疗的NMIBC小鼠膀胱；(h) 接受不同治疗的NMIBC小鼠脾脏代表照片；(i) 不同组脾脏的H&E染色图像；(j) 脾脏的CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像和定量分析（k和l），分别来自健康小鼠和接受PBS、5-ALA + 激光、NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy治疗的NMIBC小鼠。(b)的数据分析采用log-rank（Mantel–Cox）检验和Bonferroni校正（α = 0.05/T，T = 2），比较5-ALA + 激光与PBS组及NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy与PBS组。(f, g, k和l)的数据以均值±SEM表示，P值通过单因素ANOVA和多重比较检验计算

（6）基于NIR-II成像的术后监测和复发抑制评估

为了验证所提方案的术后监测效果，研究团队使用808 nm激光进行NIR-II荧光成像监测，避免了额外X射线辐射。由于纳米转换器在体内迅速清除，每次观察间隔均需重新膀胱灌注。在初始荧光强度相似的前提下，NIR-II信号显示出不同治疗组的依赖性变化趋势：未处理组、仅X射线照射组（PBS + 6 Gy和RB + 6 Gy）或仅纳米转换器组（NSs-RB-F/cRGD）中信号逐渐增强，而在纳米转换器与X射线联合处理组（如NSs-AEP + 6 Gy、NSs-RB + 6 Gy）或5-ALA + 激光治疗组中信号逐渐减弱（图6a）。NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy和5-ALA + 激光处理组在第7至21天内荧光信号完全消失，类似健康小鼠，表明肿瘤得到了有效控制。在肿瘤复发抑制的长期监测中，5-ALA + 激光处理的小鼠存活率在第56天从21天的86%骤降至43%，伴随膀胱内NIR-II荧光信号重新出现；相比之下，NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy处理组的存活率从86%轻微下降至71%，且无明显复发信号（图6b, c）。基于NIR-II荧光信号与肿瘤状况的相关性，进一步的H&E和Ki-67染色分析证实了5-ALA + 激光治疗组存在复发性NMIBC，而NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy治疗组仅出现轻度炎症或疑似原位癌的病理特征，无转移迹象（图6d, e）。免疫组化分析显示，NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy组小鼠的膀胱和脾脏中CD4和CD8细胞增殖水平显著高于5-ALA + 激光组，且脾脏结构保持完整（图6f–m）。NIR-II实时荧光成像与组织学结果一致，进一步证实了非侵入式single-f-PDT在膀胱癌复发抑制方面的稳健性。

图6.单次f-PDT术后肿瘤复发抑制监测。(a) 各组NMIBC小鼠在第0、7、14和21天的体内NIR-II荧光代表图像（每组n = 7）；(b) 第56天5-ALA + 激光组和NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy组中所有存活小鼠的体内NIR-II荧光图像；(c) 5-ALA + 激光和NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy治疗的NMIBC小鼠在56天内的生存概率；(d) 第56天解剖的5-ALA + 激光组和NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy组小鼠膀胱照片；(e) 膀胱的H&E和Ki-67染色代表图像；(f) CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像及定量分析（g和h），来自第56天5-ALA + 激光和NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy组小鼠膀胱；(i) 第56天5-ALA + 激光和NSs-RB-F/cRGD + 6 Gy组小鼠脾脏照片；(j) 脾脏的CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像及定量分析（k和l）；(m) 第56天解剖的脾脏H&E染色代表图像

（7）基于NIR-II成像的个性化剂量f-PDT疗效评估和生物安全性验证

研究人员提出基于NIR-II荧光成像的纳米转换器在膀胱癌手术前、术中和术后的应用潜力，可用于实时监测肿瘤发展并在f-PDT中定制放射剂量。通过实验室自制的NIR光子计数器系统量化了健康小鼠膀胱的信号-背景比（SBR）并将其标准值设为1.57（图7a, b）。在对照实验中，G1组和G2组的膀胱癌小鼠分别接受3 Gy和1 Gy的初始放射剂量，并依据实时SBR量化结果在后续治疗中调整剂量（图7c-e）。第56天时，G1和G2组的最终SBR分别为1.49和1.64，达到参考标准范围内，且存活率显著高于单次f-PDT或激光辅助PDT（图7f），显示出个性化f-PDT的优势。H&E和Ki-67染色分析进一步验证了NIR-II成像和个性化f-PDT的治疗效果，九只存活小鼠的膀胱和脾脏显示无病变，且CD4和CD8细胞增殖水平显著恢复（图7g–j）。解剖后观察到脾脏结构正常，未见转移迹象。这些结果表明基于NIR-II成像的非侵入式实时监测和剂量调整在治疗效果和免疫系统恢复方面的可靠性。此外，安全性评估表明，膀胱灌注纳米转换器对尿路和其他器官未引起毒性，尿液常规检查和血常规指标均在正常范围内，证明了纳米转换器的生物安全性。

图7.全程实时监测的按需f-PDT。(a) 实验室自制系统示意图（M为镜子，D为二向色镜，GSM为扫描镜，EM为发射）；(b) 四只健康小鼠的体内NIR-II荧光图像（上）及对应的信噪比（SBR，下）（n = 4）；(c) 三次分次光动力治疗（f-PDT）实验方案示意图；(d) G1组NMIBC小鼠在第0、7、14和56天的体内NIR-II荧光图像（上）及SBR定量（下）（n = 5）；(e) G2组NMIBC小鼠在相同时间点的体内NIR-II荧光图像（上）及SBR定量（下）（n = 5）；(f) G1和G2组小鼠在56天内的生存概率（n = 5）；(g) 第56天解剖的G1和G2组小鼠膀胱照片；(h) G1和G2组小鼠在第56天以及G2(x)组在第31天解剖的膀胱的H&E和Ki-67染色代表图像；(i) CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像及定量分析（j），分别来自第56天的G1和G2组及第31天的G2(x)组小鼠膀胱；(k) 第56天G1和G2组及第31天G2(x)组小鼠脾脏的H&E染色代表图像，插图为G2(x)组小鼠的脾脏照片；(l) 第56天G1和G2组小鼠膀胱照片；(m) 第56天G1和G2组存活小鼠及第31天G2(x)组小鼠脾脏重量的定量分析；(n) 脾脏CD4和CD8细胞增殖的免疫组化分析代表图像及定量分析（o），分别来自第56天的G1和G2组及第31天的G2(x)组小鼠

小结：

综上所述，该研究团队针对非侵入性膀胱癌治疗的临床需求，提出了一种纳米技术辅助的全程实时NIR-II成像导航按需分段光动力疗法（f-PDT），用于自体膀胱癌的治疗。在传统以手术切除为主、并依赖活检的诊疗体系之外，研究人员设计并实现了一种基于X射线激活的Ln-NSs纳米转换器，能够通过Ce³⁺的双重调节实现强烈的绿色和NIR-II荧光，为体内诊断、同步治疗、实时监测和长效预后提供支持。此外，通过自制的多激发快速NIR光子计数系统，实现了体内NIR-II成像的SBR定量，能实时调整辐射剂量用于术前、术中诊断及术后监测决策。尽管结果令人鼓舞，未来的研究方向包括减少辐射剂量、优化结构设计以增强NIR-II辐射荧光、扩大样本量以增强数据的统计显著性、延长监测周期评估复发抑制效果、探索成像信号与肿瘤病理负担之间的关系，并深入研究分子和细胞层面的免疫机制。总体而言，该研究团队展示了基于NIR-II成像导航的f-PDT策略在自体膀胱癌模型中的成功，表明该技术在膀胱癌治疗中具有革命性的临床价值。