糖尿病是全球十大慢性代谢性疾病中的第一位，并伴有许多严重的并发症。约20%的糖尿病患者创面愈合不良。过多的ROS，如过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（-OH）和超氧阴离子（O^2-），已被证明可诱导氧化应激，从而影响细胞活性和延缓伤口愈合。由于CeO₂表面存在丰富的氧空位，Ce³⁺和Ce⁴⁺可以可逆转化，因此CeO₂可以作为一种ROS清除剂。此外，CeO₂材料可以刺激细胞增殖和迁移，在治疗糖尿病伤口上显示出巨大的潜力。细菌感染是阻碍糖尿病伤口愈合的另一个关键因素。光热疗法是替代传统抗生素治疗的一种方法，因此该研究选择硫化钼（MoS₂）这种光热转化能力强的光热剂达高效抗菌的作用。同时，MoS₂可以通过与额外的ROS反应来清除ROS。pH值与细菌感染和血管生成等生理过程有关。监测伤口pH值可以明确伤口状态，为细菌的感染提供早期预警。基于碳量子点（CDs）的pH传感器具有操作简单、响应速度快和生物相容性好的特点。因此，通过诊疗结合，实时监测伤口组织的pH值变化，及时进行精准治疗，促进糖尿病创面愈合。

     针对上述问题，武汉理工大学戴红莲教授，通过酰胺化反应构建了硫辛酸修饰壳聚糖（LAMC）水凝胶，并将具有多巴胺结构的氧化铈-二硫化钼纳米颗粒（C@M@P）和水热合成的碳量子点（CDs）一起负载到水凝胶中，从而开发出一种诊断和治疗水凝胶（LAMC/CD-C@M@P）。通过引入CDs，该水凝胶在紫外光下表现出对pH的高度敏感性和可逆性。此外，水凝胶的图像可以使用智能手机收集并转换为伤口pH信号，为早期检测细菌感染提供了一种方法。同时，LAMC/CD-C@M@P水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有光热抗菌能力，并具有显著的抗氧化和抗炎能力，以缓解氧化应激和减轻炎症反应。该成果于2024年04月21日以《A Multifunctional Hydrogel with Photothermal Antibacterial and Antioxidant Activity for Smart Monitoring and Promotion of Diabetic Wound Healing》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202402531）。

图1.构建糖尿病伤口愈合诊断和治疗水凝胶的示意图

（1）复合水凝胶的智能pH监测能力

如图1A所示，在紫外光（365 nm）下，水凝胶的荧光强度随pH的变化而变化。利用波长290 nm ~ 350 nm的激发光评价LAMC/CD-C@M@P水凝胶的激发依赖性（图1B）。随着激发波长从290 nm增加到320 nm，荧光强度大大增强，在320 nm处达到最大。同时，随着激发波长从330 nm增加到350 nm，荧光强度下降，并伴有红移。随后，当激发光波长为365 nm时，评估水凝胶的pH敏感性。有趣的是，随着pH值从4增加到9，荧光强度呈增加趋势（图1C）。进一步的详细研究了归一化荧光强度与pH值的关系，结果表明，得到的线性曲线可以很好地拟合（图1D）。此外，CDs在不同pH值下的荧光强度变化具有高度可逆性（图1E）。综上所述，荧光强度随pH值的线性变化有利于伤口状态的实时监测。为了克服肉眼下荧光强度变化的差异，将图像转换为RGB信号，构建pH值与RGB值的对应方程，通过智能方法轻松获得pH值（图1F）。在紫外光（365 nm）下，随着pH的增加，R值逐渐减小，G值保持不变，B值逐渐增大。通过G+B与pH值的拟合得到相应的方程（图1G）。

图2.水凝胶的智能pH监测功能。A）水凝胶在紫外光（365 nm）下的荧光强度变化。B）水凝胶在不同激发波长下的荧光强度。C）水凝胶在不同pH值（365 nm激发波长）下的荧光强度。D）荧光强度与pH值之间的线性关系。E）水凝胶在pH值为4至9（365 nm激发波长）内的可逆性。F）将图像转换成RGB信号。G）G+B与pH值的拟合曲线

（2）物理性质和活性氧清除能力

通过搭接剪切强度实验测量复合水凝胶的剪切黏结力（图2A）。结果表明，随着NPs的加入，粘附力增加（图2B）。在图2C中，与LAMC水凝胶相比，LAMC-P水凝胶的压缩性能下降，主要是由于PDA的良好粘附性能，这导致水凝胶对外力的抵抗力下降。图2D表明，LAMC水凝胶迅速溶胀，最终溶胀比为18.85±0.73。21天后，图2E显示，LAMC、LAMC-P、LAMC-C@P、LAMC-M@P、LAMC-C@M@P和LAMC/CDC@M@P的降解率分别为56.89±2.78%、62.93±1.48%、68.15±0.80%、46.54±2.91%、48.92±0.71%和55.22±1.80%。这种变化可能归因于带正电荷的P和CeO₂与LAMC中的羟基之间的相互作用，这可能导致水凝胶内交联密度的差异。如图2F所示，LAMC水凝胶显示出5.21±1.87%的H₂O₂清除能力，而LAMC-P、LAMC-C@P、LAMC-M@P、LAMC-C@M@P和LAMC/CDC@M@P水凝胶显示出越来越高的清除能力，分别为38.10±0.48%、44.58±1.93%、40.85±4.48%、55.66±1.34%和55.29±0.32%。对于-OH和O^2-清除能力也观察到类似的趋势。在图2G，H中，显示了LAMC水凝胶显示出分别为23.65±2.91%和22.19±6.33%的-OH和O^2-清除能力，并且对于LAMC/CD-C@M@P水凝胶，进一步增加到53.67±0.86%和57.93±6.89%。

图3.复合水凝胶的表征。A）粘合强度试验示意图。B）水凝胶的粘合强度。C）复合水凝胶的可压缩性。D）水凝胶在pH为7.4的PBS中的溶胀比。E）水凝胶在pH为7.4的PBS中的降解性能。水凝胶的ROS清除率：F）H₂O₂ 、G）-OH 和 H）O^2-

（3）光热性能和近红外辅助抗菌性能

在1.0w cm^-2的功率下，水凝胶的温度逐渐升高，而LAMC水凝胶保持在25.0°C至26.7°C的温度范围内(图3A)。复合水凝胶的抗菌性能通过直接接触菌液来测定。如图3D所示，在对照组和对照组+ NIR组中，固体培养基平板上出现了大量的活细菌菌落，表明NIR辐射对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(的生长没有影响。在LAMC组中，LAMC水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率分别为25.83±6.43%和17.71±6.48%，这主要归因于带正电荷的壳聚糖吸引了细菌的负电荷，破坏了细菌细胞膜的通透性和流动性(图3B-C)。在图3E中，在对照组和对照组+ NIR组中，细菌保持光滑完整的球形或杆状。当用808 nm NIR处理LAMC/CD-C@M@P水凝胶10分钟时，细菌细胞膜被严重破坏，内容物从细胞中流出。因此，C@M@P NPs产生的光热效应在抗菌过程中发挥了关键作用，显示出降低伤口感染风险的巨大潜力。

图4.复合水凝胶的光热和抗菌性能。A）水凝胶的光热升温曲线。B-D）金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抗菌实验中的图像和定量数据。E）金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SEM图像

（4）生物相容性和细胞迁移

如图4A所示，在第一天和第三天没有观察到明显的细胞毒性。然而，L929细胞在所有水凝胶组中的存活率超过95%，显示出复合水凝胶良好的生物相容性，活/死染色结果(图4D)进一步证实了细胞相容性。细胞迁移是伤口愈合过程中的重要步骤。因此，通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)分析和细胞划痕实验，使用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来评估水凝胶对细胞迁移的影响(图4B，E)。从图4E可以看出，对照组和LMAC组的细胞迁移结果大体一致，而LAMC/CDC@M@P组在促进细胞迁移方面表现出最佳影响。定量结果（图4C）显示，LAMC治疗/CD-C@M@P水凝胶在24小时后导致细胞划痕覆盖率为65.24±1.13%，超过了对照组（37.07±2.16%）和LAMC组（43.19±2.27%）。

图5.复合水凝胶的体外细胞相容性和细胞迁移。A）L929细胞B）HUVECs孵育1、3、5天后的细胞存活率。D）孵育24小时后L929细胞的活/死染色。E）不同时间（0、12、24 h）的细胞迁移照片和C）相应的定量数据

（5）抗氧化和抗炎能力

为了验证复合水凝胶在体内的抗氧化能力，H₂O₂处理的L929细胞被用作氧化应激模型。与正常组相比，对照组和LAMC组的OD值显著降低，存活率分别为23.57%和31.58%，并且在荧光显微镜下观察到更多的死亡细胞(图5A)。在用H₂O₂刺激后，在对照组中观察到细胞中的荧光强度，表明细胞内ROS水平升高(图5B)。相比之下，LAMC组显示出较弱的荧光强度，LAMC/CD-C@M@P组的活性氧水平进一步下降。为了评价复合水凝胶的抗炎活性，研究了它们在脂多糖(LPS)诱导后对RAW264.7细胞的M1/M2表型相关基因表达的影响。在LPS刺激后，M1相关基因(IL1β、iNOS和TNF-α)急剧增加(图5D–F)。在LAMC组，IL-1β和TNF-α的表达略有抑制，而iNOS的表达略有增加。重要的是，LAMC/CD-C@M@P组显著抑制了炎症状态下IL-1β、iNOS和TNF-α的表达。对于M2相关基因(Arg-1、TGF-β和IL-10)，与LPS和LAMC组相比，LAMC/CD-C@M@P组增加了这些基因的表达，如图5G-I所示。在LAMC组中，观察到轻微程度的分化，定量荧光强度是正常组的1.55±0.23倍。值得注意的是，LAMC/CD-C@M@P组表现出明显的神经分化，定量荧光强度达到正常组的4.98±0.27倍(图5J)。

图6.复合水凝胶的抗氧化和抗炎作用。A）H2O2处理的L929细胞的细胞存活率。B）H2O2处理后L929细胞内ROS水平。C）细胞内ROS水平的荧光强度。D）白细胞介素-1β（IL-1β）、E）诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、F）TNF-α、G）人精氨酸酶-1（Arg-1）、H）转化生长因子-β（TGF-β）和I）白细胞介素-10（IL-10）的相关基因表达。K）第7天PC12细胞的免疫染色图像。J）β3-微管蛋白的荧光强度

（6）体内pH监测和伤口愈合

通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立SD大鼠糖尿病模型。该研究的进展详见图6A。在血糖水平高于16.7 mM达7天后，将大鼠随机分为对照组、LAMC组和LAMC/CD-C@M@P组。在感染初期，伤口的pH 值从酸性逐渐升高到碱性，提示细菌感染的发生。通过近红外光照射，水凝胶的光热治疗功能激活，降低了伤口的 pH值并消除了感染。实验显示，水凝胶不仅能够有效实时监测伤口的pH，还能通过光热效应杀灭细菌。此外，水凝胶在14天的伤口愈合过程中表现出优异的促进效果。与对照组和单纯LAMC组相比，LAMC/CD-C@M@P组的伤口愈合速度更快，愈合率达到94.73%。这些结果表明，LAMC/CD-C@M@P水凝胶能够显著加快糖尿病伤口的愈合，减小感染的风险，并促进整体伤口修复过程。

图7.水凝胶在糖尿病伤口中的体内研究。A）治疗大鼠糖尿病伤口的实验程序。B）糖尿病伤口的建立、监测和治疗的示意图。C）不同时期伤口的代表性照片。D）体内pH监测。E）第3天各组的细菌存活率。F）不同时期不同组的伤口愈合率。G）不同组的伤口愈合过程示意图

（7）组织学和免疫荧光分析

通过免疫荧光染色和组织学分析评估LAMC/CD-C@M@P水凝胶的组织再生能力。苏木精-伊红(H&E)染色证明，LAMC/CD-C@M@P组在第14天后显示最小的伤口长度(959.33±13.05微米)，并且显示更少的炎性细胞以及更高程度的伤口闭合(图7A，C)。图7B显示了Masson染色的结果，显示与其他组相比，LAMC/CD-C@M@P组中胶原沉积的蓝色增加且加深。数据的定量分析进一步表明，LAMC/CD-C@M@P组的胶原沉积率(60.14±2.18%)高于对照组(27.24±2.41%)和LAMC组(43.88±4.35%)。进行白细胞介素-6 (IL-6)和CD31的免疫荧光试验，以评估第7天的皮肤伤口修复。如图8A、E所示，与对照组和LAMC组相比，LAMC/CD-C@M@P组表现出最低的IL-6表达，表明炎症反应减少。此外，图8B、F显示了LAMC中CD31的高表达/CD-C@M@P组，提示促进新血管形成。随后，在第14天对CD86和CD206表达的评估显示，LAMC中M1相关生物标志物减少，M2相关生物标志物质增加/CD-C@M@P组与其他组相比，表明LAMC/CD-C@M@P水凝胶可以促进巨噬细胞向M2的分化，并表现出抗炎作用。为了评估神经发生和血管生成，在第14天进行了CD31和β3tubulin的免疫荧光染色(图8D，I，J)。CD31的表达出现在对照组和LAMC组，表明有一定的血管生成，几乎没有观察到β3-tubulin.的表达在LAMC/CD-C@M@P组中，CD31和β3-tubulin的荧光强度最明显，表明可观察到神经和血管的整合再生。

图8.伤口组织的组织学分析A）H&E染色和B）Masson染色在第14天的显微照片。C）伤口长度和D）胶原沉积的统计分析

图9.A）IL-6、B）CD31在不同组织创面中第七天的免疫荧光染色结果。C）巨噬细胞、D）CD31和β3-微管蛋白在不同创面组织中第14天的免疫荧光染色结果。E）IL-6、F）CD31、G）CD86、H）CD206、I）CD31和J）β3-微管蛋白在第14天的荧光强度

研究小结：

该研究提出了一种具有pH监测、光热抗菌、抗氧化和抗炎性能的新型诊断和治疗水凝胶。在壳聚糖基水凝胶中掺入CDs使其具有光致发光，其荧光强度随pH值的变化而变化。这一特性使水凝胶可以作为pH传感器，通过荧光信号精准地检测伤口的pH值，为评估伤口状态提供了一种方法。LAMC/CD-C@M@P水凝胶在体外表现出良好的机械性能、光热转换能力和近红外下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能。此外，复合水凝胶还能有效缓解氧化应激，减轻炎症反应，改善糖尿病创面微环境，促进糖尿病创面愈合。因此，该研究为糖尿病创面提供了一种新的诊疗一体化治疗策略。