细胞可以通过全细胞运动，如扩散、迁移或体积膨胀，在三维空间上改变其局部生态位。这些行为持续数小时至数天，影响包括分化在内的长期细胞命运。涉及细胞周围生态位物理变形的细胞行为通常由涉及多个亚细胞水平信号变化的机械转导途径介导，从ECM -细胞膜界面-细胞骨架和细胞核。尽管黏附配体和细胞骨架在细胞机械传感中的作用已被广泛研究，但细胞核的机械传感作用尚未得到广泛研究。先前的研究报道了快速的亚细胞动力学，如细胞骨架的变化和局灶黏附，发生在秒的时间尺度。然而，对三维环境中全细胞运动的研究，如细胞扩散、迁移和体积膨胀，都集中在更长的时间尺度上，从几小时到几天不等。目前尚不清楚三维全细胞运动是否可以在更快的时间尺度上发生，以及这种快速的细胞运动如何影响细胞的长期命运，如分化。

针对上述问题，美国斯坦福大学杨帆团队报告了在分钟时间尺度上发生在滑动水凝胶中的全细胞运动，称为细胞翻转，其特征是三维细胞动力学和水凝胶变形，由秒到分钟尺度的细胞骨架和核活动引起。抑制或促进间充质干细胞的细胞翻滚的研究表明，这种行为增强了向软骨细胞的分化。此外，它还与全局染色质可及性的降低有关，而这是增强分化所必需的。细胞翻滚也发生在分化为其他谱系的过程中，其促进分化的作用在不同的水凝胶平台上得到了验证。研究结果表明，细胞翻滚是干细胞分化的一个额外调节因子，由快速生态位变形和核机械转导介导。该文章于2024年9月30日以《Cell tumbling enhances stem cell differentiation in hydrogels via nuclear mechanotransduction》为题发表于《Nature Materials》上。（DOI：10.1038/s41563-024-02038-0）。

（1）MSC软骨形成增强与细胞翻滚有关

为研究局部ECM如何调节MSC分化，研究团队使用PEG基SG和CG系统评估MSC软骨形成。SG具有可滑动的交联结构，使细胞可根据力重新组织水凝胶网络（图1a）。SG和CG的交联均为不可逆的共价键，且在细胞时间尺度上表现弹性（图1c右）。通过动态光散射微观流变学，团队发现SG在局部比CG更柔软约5倍，使细胞更易变形局部环境（图1c左）。结果显示，SG显著增强了MSC软骨形成，第21天软骨基质沉积增加（图1b）。活细胞成像显示，SG中的MSC表现出动态翻滚和局部快速变形，而CG中的MSC几乎静态（图1d-h）。AFM测试表明，SG在变形时力响应渐进，允许更大变形，便于细胞重组局部基质并促进翻滚（图1i-j）。

图1. 增强的MSC软骨形成与分钟尺度的三维细胞翻滚有关。 a. 示意图说明 SG 与 CG，具有移动或静态交联和配体。b. 代表性Safranin O染色显示 MSCs 在 SG（顶部）和 CG（底部）中经过 21 天的软骨诱导后沉积 sGAG。c. 通过基于动态光散射的微流变学（左；每种条件N  = 3 种凝胶）和本体平行板剪切流变学（右）获得的SG和 CG 的代表性储存和损耗模量。d-h. 细胞翻滚的特征。d. SG（顶部）和 CG（底部）中单个活细胞的延时图像序列。e . d中SG（顶部）和 CG（底部）中相应细胞的标记水凝胶的延时图像序列。f. SG（顶部）和 CG（底部）中单个细胞随时间变化的叠加颜色编码轮廓。g. 时间上细胞形状的相关系数，比较时间t > 0时的细胞形状 与时间t=0 时的形状 。h. 细胞长轴的质心速度（左）和角速度（右）。i. 从 SG、CG 和 SG50:CG50 上的 AFM 点压痕获得的力-应变曲线（左）。从力-应变曲线得出的 SG、CG 和 SG50:CG50 中具有相同大小的力的应变（右）。 j. SG50:CG50 中的细胞翻滚（左）质心速度和长轴角速度（右）

（2）翻滚与增强的亚细胞动力学有关

考虑到细胞翻滚与快速动力学相关，研究团队进一步探索亚细胞层级的动力学，包括外基质、细胞骨架和细胞核。通过跟踪水凝胶中荧光珠的位移，研究团队发现，与CG相比，SG中的细胞翻滚在15分钟内引发显著增强的细胞周围基质变形，最大达1µm（图2a）。由于翻滚与基质变形有关，团队推测SG中的细胞骨架动力学更强。利用Lifeact标记的MSCs，观察到SG中秒级的F-actin动态增强，特别是在动态突起处（图2b-f）。进一步计算F-actin的动态面积变化，结果表明SG中的F-actin动力学显著更高（图2d-f）。尽管传统认为细胞核主要存储遗传物质，但证据表明其也感知机械力。研究团队通过活细胞核染色（5分钟间隔）发现SG中的细胞核流动性显著增强，平均速度是CG的5倍，且在16小时内移动距离更大（图2g-i）。在翻滚过程中，细胞和细胞核的运动速度和方向呈强正相关（图2j，k）。

图2.细胞翻滚与MSCs中增强的数秒到数分钟尺度的细胞骨架和核动力学有关。a. 左：通过跟踪SG（上）和CG（下）的埋头位移确定的15分钟内矩阵变形的代表性热图。b. 左：SG（上）和CG（下）细胞中F-actin的代表性图像。c. 三个独立实验中观察到的SG（上）和CG（下）30 s内F-actin突出物的代表性变化。d. 连续两个时间段间F-actin动态面积（获得面积+损失面积）的计算示意图。e.  SG中一个单元和CG中一个单元动态区域的幅度和波动的代表性示例（间隔5秒，总周期为5分钟）。f. F-actin动力学定量作为平均动态面积（间隔5-s，总周期为5 min）。g. SG（上）和CG（下）单个细胞核的延时图像序列。h. SG和CG细胞核的代表性运动轨迹。i. 核移动速度（5分钟间隔，总周期16h）（左）和总移动距离（超过16h）（右）的量化。j. 细胞和细胞核运动的代表性例子（左）的速度和（右）的角度的单个细胞在细胞翻滚随着时间的推移。k. 细胞翻滚过程中细胞与细胞核速度和角度（方向）相关性的Spearman相关值

（3）翻滚驱动MSC软骨形成的机制

研究团队进一步检查了21天培养期间细胞翻滚的持续时间，在SG分化的第0天（包封后）、第2天和第4天进行了分钟级活细胞成像。到第4天，SG中的MSC翻滚显著下降至CG水平（图3a），伴随亚细胞动力学的减少，包括基质变形（图3b, c）、F-actin动力学（图3d）和核运动速度（图3e）的降低。这表明MSC软骨形成的前3-4天翻滚最为活跃，提示早期动力学对软骨形成至关重要。为验证SG增强软骨形成是否需要关键的翻滚时间窗，研究团队在不同时间用blebbistatin处理SG中的MSC以抑制翻滚，结果显示软骨形成显著下降至CG水平（图3f, g）。第3天后抑制对软骨形成影响较小，表明前3天是增强软骨形成的关键时间窗口。总体而言，早期（<4天）驱动翻滚的机制对于增强MSC软骨形成至关重要。

图3. 早期细胞翻滚是增强MSC软骨形成的必要条件。a. 诱导成软骨不同天数细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）。b. 通过跟踪在不同天的软骨诱导的嵌入头位移确定的15分钟内基质变形的代表性热图。c. 量化不同软骨诱导天数15 min内最大基质位移。d. 在诱导成软骨的不同天数，活细胞F-actin动力学的定量（间隔5-s，总时间为5分钟）。e. 诱导成软骨不同天数的核速度量化。f. Blebbistatin治疗方案强调在21天软骨诱导期的不同天的治疗。g. 三个独立实验中观察到，在不同时间的blebbistatin阻断SG后，21天软骨诱导后sGAG沉积的冷冻切片样品上具有代表性的Safranin O组织学

（4）翻滚与受抑制的染色质状态有关

越来越多的证据表明，细胞核和染色质对外力具有高度机械敏感性。鉴于细胞核在翻滚过程中更活跃，研究团队假设这种行为改变了核的机械感知和染色质状态，从而调节SG的软骨形成。为验证此假设，该团队通过层粘连蛋白A/C和表观遗传标记H3K9me3表征MSC的核机械负荷，发现SG中的MSCs在这两种标记物上表现出更高表达和更强的核层定位（图4a-d），表明翻滚增加了核机械负荷。为全面了解翻滚对MSC染色质可及性的影响，团队在SG和CG包封后16小时使用ATAC-seq进行染色质可及性测定。 前10,000个基因组区域的PCA分析显示SG和CG来自不同集群，且SG的基因组区域整体可及性下降（图4e-g），表明翻滚与异染色质形成有关。接下来，该团队在前3天使用催产素、GSK343和garcinol分别抑制H3K9me3、H3K27me3和AcK，这些处理显著减少了第21天的软骨形成（图4h），证实异染色质的形成对于增强软骨形成至关重要。此外，尽管翻滚未改变AcK的诱导，组蛋白乙酰化仍在软骨形成中发挥重要作用，因为它可能保持了谱系特异性基因的可及性。

图4. 细胞翻滚与被抑制的整体染色质状态有关，这是在三维上增强MSC软骨形成所必需的。a, b. 24小时软骨诱导后与核机械负荷和染色质可及性相关标记物的代表性western blotting图像(a)和定量 (b)。c. 软骨诱导24小时后SG（上）和CG（下）不同标记物的代表性免疫荧光图像。d. 基于不同标记物的免疫荧光成像，量化信号强度沿核边界距离的核定位。e-g. 诱导成软骨16小时后的ATAC-seq分析。e. 方差最大的前10000个可达染色质区域的主成分分析。f. 火山图表示SG与CG差异分析后基因组区域的可达性模式。g. SG和CG之间差异有统计学意义的前50个基因组区域热图。h. 上图：21天软骨诱导期前3天不同染色质抑制剂的治疗方案。下图：三个独立实验中观察到的不同染色质抑制剂诱导成软骨21天后sGAG沉积的冷冻切片样品上具有代表性的Safranin O组织学

（5）翻滚可以通过PLA2信号传导调节MSC软骨形成

鉴于细胞骨架-核耦合对细胞翻滚和增强软骨形成至关重要，研究团队进一步探索核机械传感的作用。最近，核拉伸已被视为机械传感器，可激活胞质cPLA2信号传导并产生花生四烯酸（ARA），从而增强细胞骨架动力学（图5a）。实时成像显示SG的核在秒级时间尺度上变形增多（图5b-d）。量化分析显示，SG的核区波动明显高于CG（图5c，d），表明细胞翻滚与核拉伸增加相关。随后，该团队观察到SG的核变形和cPLA2信号显著增强，用blebbistatin抑制翻滚可降低cPLA2和p-cPLA2表达（图5e）。接着，该团队评估了PLA2信号对翻滚的调节，用AACOCF3抑制PLA2减少了SG中的翻滚和核运动，而外源ARA补充则增强了这一过程（图5f，g）。尽管ARA在CG中影响较小，但适度提高了核速度。最终，该团队在SG和CG的分化前3天用AACOCF3或ARA处理，结果显示PLA2抑制减少了第14天的软骨形成，而ARA促进了SG中的软骨基质沉积（图5h）。 上，翻滚与PLA2信号增强密切相关，可用于促进三维分化。

图5.细胞翻滚与增强的核拉伸和PLA2信号有关，这可以调节以增强MSC软骨形成。a. PLA2-ARA核机械感应途径示意图，细胞核通过该途径感应和转导约束并激活肌动球蛋白收缩性。b. 用H2B-eGFP标记的部分细胞核的秒尺度延时图像序列，突出了SG（上）和CG（下）的核变形。c. 一个SG和一个CG的核面积波动超过60秒（3-s间隔）的代表性例子。d. SG和CG超过60 s的平均核面积波动。e. 诱导成软骨24小时后PLA2信号相关标志物的代表性western blotting图像（左）和定量图像（右）。f. 细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）对SG和CG中PLA2抑制和ARA补充的响应。g.  SG和CG中PLA2抑制和ARA补充对核速度的响应。h. 通过三个独立的实验观察到，通过抑制PLA2和在SG中补充ARA诱导成软骨14天后，sGAG沉积的冷冻切片样品上具有代表性的Safranin O组织学

（6）细胞翻滚发生在三维的各种场景中

  在确认翻滚影响MSC软骨形成后，研究团队进一步探索其在MSC成骨和脂肪形成中的作用。组织学分析（图6a,c）显示，与CG相比，SG增强了MSC成骨和脂肪生成。包被后1小时起，该团队观察到SG中的细胞在成骨和脂肪形成过程中持续翻滚，而CG中的细胞翻滚最小（图6b, d）。这些结果表明，细胞翻滚与增强的多谱系分化相关。随后，该团队测试了翻滚在其他3D可降解和粘弹性水凝胶平台上的表现，发现酶降解和粘弹性水凝胶同样支持细胞翻滚，并显著增强了MSC软骨形成（图6e-h）。这些结果表明，细胞翻滚是一种在三维环境中适用于多种细胞类型的物理行为，具有广泛的细胞生物学和组织应用潜力。

图6.细胞翻滚与向其他谱系的三维分化增强有关，发生在各种水凝胶平台上。a. SG（上）和CG（下）成骨诱导28天后，具有代表性的茜素红S冷冻切片样品的矿物沉积组织学。b.成骨诱导第0天细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）。c. SG（上）和CG（下）诱导成脂28天后，固定全凝胶样品的代表性油红O染色，脂肪滴形成。d. 第0天细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）。e. 在可降解CG（上）和CG（下）中诱导成软骨14天后，sGAG沉积的冷冻切片样品上具有代表性的红花素O组织学。f. 诱导成软骨第0天细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）。g. 粘弹性CG（上）和CG（下）诱导成软骨14天后sGAG沉积的冷冻切片样品中具有代表性的红花素O组织学。h. 诱导成软骨第0天细胞长轴质心速度（左）和角速度（右）。i. 分钟尺度细胞翻滚的示意图，以及相关的时间尺度和分子机制

研究小结：

该研究团队报告了一种以前未知的细胞行为，称为细胞翻滚，涉及局部包含的分钟尺度的全细胞运动，这种运动使细胞周围ECM物理变形，并调节长期分化结果。该研究团队的研究强调了一个事实，即翻滚增强的分化涉及多个时间尺度：(1)发生在秒到分钟尺度上的快速细胞翻滚、细胞骨架和核动力学；(2)在诱导的最初几天中，这些关键相互作用的时间和持续时间，随后调节干细胞的长期分化。因此，对数秒到数分钟尺度的细胞- ECM相互作用的早期控制可以关键地调节细胞的长期命运。虽然该研究团队的研究主要集中在MSCs和软骨形成上，但翻转增强分化的生物学原理和时间尺度可能广泛适用于在各种组织再生或疾病进展背景下增强干细胞分化和调节其他细胞命运。