树突状细胞（DCs）在启动和协调针对癌症的适应性免疫反应中起着关键作用，但其功能通常受限于抗原递送。为了实现有效的抗原递送和疫苗接种，疫苗需要首先积聚在淋巴结（LNs）中，在那里进行抗原呈递和免疫反应，随后被DCs摄取以处理抗原并刺激抗肿瘤免疫反应。因此，近年来的研究重点在于开发增强抗原递送至淋巴结和DCs的纳米疫苗，以诱发强大的免疫反应。尽管DCs靶向策略被认为是理想的，但并非所有DCs都表达靶标受体，且DCs上这些受体的表达存在异质性，从而降低了抗原递送的有效性，并可能引发免疫相关的不良事件。因此，需要识别可靠的DC受体并开发创新的疫苗接种策略，以改善免疫效果。

针对上述问题，四川大学华西医院米鹏教授团队从树突状细胞（DCs）的代谢问题上寻找突破口，结合糖酵解对DCs的生存和免疫功能的重要性，以及Glut-1作为葡萄糖转运蛋白，可以上调DC激活过程，是抗原递送和免疫治疗的潜在靶点，成功开发了一种用于靶向树突状细胞（DCs）葡萄糖基化纳米疫苗（GluOVANPs和GluNeoNVs），以提高抗原递送和增强免疫反应。GluOVANPs通过靶向DCs递送卵清蛋白，显著提高了对B16黑色素瘤的免疫应答和记忆T细胞反应，而GluNeoNVs则通过递送新抗原，诱发了对MC38结肠肿瘤的特异性免疫反应。研究结果表明，Glut-1是一个有效的靶点，靶向该分子的纳米疫苗能够显著增强癌症免疫治疗的效果。该文章于2024年8月30日以《Glucosylated Nanovaccines for Dendritic Cell-Targeted Antigen Delivery and Amplified Cancer Immunotherapy》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c0905）。

图1. 糖基化纳米疫苗DC靶向抗原递送精准肿瘤免疫治疗方案示意图：针对DC上Glut-1的糖基化纳米疫苗可以递送常规抗原和肿瘤特异性新抗原，从而触发DC成熟，并刺激强大的适应性免疫反应和记忆T细胞，用于癌症免疫治疗。

（1） Glut-1在人和动物DC细胞上表达

研究表明，Glut-1在健康供体和动物的树突状细胞（DCs）上高表达，并且在DC激活过程中表达水平上调（图2b-d）。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、Western blot（WB）和流式细胞术分析，确认了Glut-1在DCs上的高表达，并且其在DC暴露于不同刺激因子（如TNF-α、IL-6、LPS）时的表达显著增加。与流式细胞术检测的巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞等腹股沟LNs的其他免疫细胞相比，Glut-1 (Glut-1/Control)在dc上的相对表达量最高（图2e），这表明Glut-1是一个有效的DC靶向标记物，为高特异性抗原递送提供了有力的支持。Glut-1的上调也提示通过多次接种疫苗可能增强免疫反应。

图2. Glut-1在人和动物DC上的表达。（a）从人类供体和动物中获得用于Glut-1鉴定的未成熟和成熟hdl-c和bmdc的方法；（b−d）代表性的CLSM图像（b）和WB分析（c, d）显示，在有/没有刺激的情况下，hDCs、BMDCs和DC2.4细胞上稳定表达Glut-1；（e）有代表性的流式细胞术结果显示，与LNs中其他免疫细胞相比，Glut-1在DC上的相对表达量最高。

（2） GluOVANPs靶向DC递送抗原并触发DC激活

为了在树突状细胞（DCs）上靶向Glut-1进行抗原递送，该研究使用卵清蛋白（OVA）作为常规抗原，通过生物矿化方法制备了糖基化卵清蛋白纳米疫苗（GluOVANPs），作为活性靶向疫苗，与不含葡萄糖配体的OVA负载纳米疫苗（OVANPs）进行了对比（图3a）。GluOVANPs由用于磁共振成像（MRI）的纳米晶氧化钆（Gd₂O₃）核和用于激活DCs的OVA抗原壳组成。动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）测量结果显示（图3b-c），OVANPs和GluOVANPs均为单分散球形，直径分别为21 nm和28 nm。这些纳米疫苗的直径小于100 nm，具备亲水性和负电荷特性，有助于其在大量淋巴结（LNs）中迁移并定位于树突状细胞，从而促进免疫反应。其他表征结果证明了纳米疫苗的合成以及良好的生物相容性。在被细胞摄取能力检测中，GluOVANPs被摄取量是OVANPs的7倍（图3d-e）。使用Glut-1抑制剂根皮素阻断BMDCs上的Glut-1，结果表明GluOVANPs的摄取量显著下降，与阻断组相当（图3f）。此外，与OVANPs和OVA相比，GluOVANPs表现出更大的内体逃逸（图3g），表明糖基化改进了OVA抗原的细胞内递送。这种增强的细胞内递送有助于提高抗原对CD8⁺ T细胞的递呈，从而刺激更强的免疫反应。结果如图3h-i所示，不同处理后，GluOVANPs诱导的BMDCs和DC2.4细胞成熟率和细胞表面SIINFEKL肽量显著高于OVA和OVANPs，显示出更有效的抗原交叉呈递。同时，GluOVANPs促进了BMDCs和DC2.4细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-12p70的分泌，这证实了GluOVANPs可以触发强烈的DC激活，显著改善抗原递送和免疫应答，增强免疫治疗。

图3. 用于体外DC靶向抗原递送的GluOVANPs纳米疫苗的制备。（a）示意图显示OVA抗原、OVANPs和GluOVANPs，葡萄糖（红色三角形）被偶联到OVA壳上；（b）DLS图显示OVANPs和GluOVANPs是单分散的；（c）OVANPs和GluOVANPs的TEM图像，比例尺为100 nm；（d）通过流式细胞术测量暴露于Cy5标记的OVA、OVANPs或GluOVANPs后24小时BMDCs对疫苗的相对细胞摄取；（e）BMDCs摄取Cy5标记的OVA、OVANPs和GluOVANPs的代表性CLSM图像（红色：OVA；蓝色：核）；（f）代表性流式细胞术结果显示，经根皮素阻断或不阻断Glut-1处理的BMDCs对疫苗的细胞摄取（30分钟），然后暴露于Cy5标记的OVA、OVANPs或GluOVANPs 6小时；（g）Cy5标记的疫苗胞浆递送至DC的代表性CLSM图像；（h−k）PBS、OVA、OVANPs和GluOVANPs处理的BMDCs体外DC成熟（h）和OVA抗原交叉呈递效果（i），以及TNF-α（j）和IL-12p70（k）的分泌

（3）GluOVANPs的体内LN积累

纳米疫苗通过将抗原递送到树突状细胞（DC），并在引流淋巴结（LNs）中触发CD8⁺ T细胞反应，以实现有效接种。接种OVANPs和GluOVANPs的小鼠腹股沟LNs的对比度增强，表明疫苗在LNs中的迁移（图4a-b）。同时，GluOVANPs的迁移量明显高于其他处理组（图4c-g）。免疫荧光成像显示，从GluOVANPs组和OVANPs组切除的LNs更大且含有更多的DC，较OVA组更多。另外，GluOVANPs能深入渗透到LNs中（图4h），并广泛与DC相互作用。

图4. GluOVANPs将抗原传递给LNs。（a, b）接种后腹股沟LNs（黄色圆圈）累积OVANPs（a）和GluOVANPs（b）的MR图像；（c−e）接种24小时后小鼠（c）和腹股沟LNs（d）中Cy5标记的OVA、OVANPs和GluOVANPs的IVIS图像显示，GluOVANPs在LNs中的积累最高（e）；（f、g）代表性IVIS图像显示Cy5标记的OVA、OVANPs和GluOVANPs在LNs、肿瘤和主要器官中的生物分布（f），GluOVANPs在LNs中的积累最高；（h）腹股沟LN切片的代表性荧光图像显示GluOVANPs（红色）与DCs（绿色）明显共定位（黄色）

（4）GluOVANPs将抗原传递到LNs中的DC并在体内引发强烈的免疫反应

为了研究体内树突状细胞（DC）的靶向行为，免疫标记和流式细胞术分析表明C57BL/6小鼠淋巴结（LNs）中的DC表达Glut-1（图5a），结果表明GluOVANPs能够靶向这些细胞，并且被DC摄取的量显著高于其他处理组（图5b）。进一步分析表明，与其他疫苗（如OVANPs）和免疫细胞（如巨噬细胞）相比，GluOVANPs在DC的细胞摄取水平高达76.50%（图5c），说明糖基化的纳米疫苗能显著改善抗原在LNs中的递送（图5c）。此外，与PBS、OVA和OVANPs相比，GluOVANPs接种小鼠在LNs中表达CD86⁺CD80⁺ CD11c⁺成熟DC的百分比和CD11c+SIINFEKL-H-2Kb+抗原交叉表达DC的百分比最高（图5d-g）。GluOVANPs接种小鼠的脾细胞中分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞百分比和血液中IFN-γ的水平也显著高于OVA和OVANPs接种小鼠（图5h-i）。经过三次免疫后，GluOVANPs在脾脏中产生的中枢记忆T细胞（TCM）和效应记忆T细胞（TEM）数量最多（图5j-k），显示出强烈的全身免疫反应和免疫记忆，这对肿瘤的免疫治疗非常重要。

图5. GluOVANPs将抗原传递给LNs中的DC，在体内引发强烈的免疫反应。（a）代表性流式细胞术直方图显示Glut-1在LNs的DC上表达；（b）细胞内DC摄取的Cy5标记的OVA、OVANPs和GluOVANPs的定量测定，DC用抗CD11c-FITC标记；（c）B细胞、T细胞、DC细胞、单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞对Cy5标记的OVA、OVANPs和GluOVANPs的相对细胞摄取；（d, e）代表性流式细胞术直方图（d）和结果（e）显示，接种后GluOVANPs诱导DC成熟的比例最高；（f, g）代表性流式细胞术直方图（f）和结果（g）显示，GluOVANPs在免疫后的LNs中诱导抗原交叉呈递DC的比例最高；（h）免疫后再刺激脾细胞中分泌IFN-γ的CD8+ T细胞百分比；（i）免疫后小鼠血清IFN-γ水平；（j, k）三次免疫后第7天脾脏（CD3+CD8+门控）中TEM（j）和TCM（k）的百分比

（5）GluOVANPs在体内预防和抑制黑色素瘤

按照图6a的时间线和处理流程，包括小鼠的免疫时间和肿瘤接种时间，建立动物模型。结果如图6b-d所示，GluOVANPs处理组肿瘤生长速度最低，存活率最高，其他处理组小鼠均死亡。进一步评估根除已建立肿瘤的免疫治疗效果，结果表明，与Montanide ISA-51+Poly(I:C)+OVA或OVA免疫的动物相比，OVANPs和GluOVANPs免疫的动物肿瘤生长速度更低，存活时间更长（图6f-g）。尤其接种GluOVANPs的小鼠肿瘤明显更小，47天存活率（66.7%）更高（图6h）。这些结果表明，接种GluOVANPs可以有效地消融现有肿瘤，延长体内生存期。

图6. GluOVANPs在体内预防和抑制黑色素瘤肿瘤生长。（a）预防B16OVA肿瘤的疫苗接种计划；（b−d）B16OVA黑色素瘤肿瘤的平均（b）和个体（c）肿瘤生长曲线，以及不同处理后免疫小鼠的生存曲线（d）；（e）治疗B16OVA肿瘤的疫苗接种计划；（f−h）接种OVA、Montanide ISA-51+Poly(I:C)+OVA、OVANPs或GluOVANPs免疫小鼠的B16OVA肿瘤平均（f）和个体（g）肿瘤生长曲线和存活曲线（h）

（6）GluOVANPs在巨噬细胞缺失和DC缺失动物模型中的免疫治疗评价

在巨噬细胞缺失小鼠模型中，GluOVANPs与OVANPs的免疫治疗效果和在未进行巨噬细胞缺失相似，表明巨噬细胞的缺失对疫苗的治疗效果影响较小。然而，在DC缺失小鼠模型中，无论是GluOVANPs还是其他疫苗，其治疗效果几乎完全丧失。这表明GluOVANPs主要通过作用于树突状细胞（DC）发挥其治疗作用（图7）。因此，DC是GluOVANPs及其他类似疫苗实现有效治疗的关键细胞类型。

图7. GluOVANPs用于巨噬细胞缺失和DC缺失动物模型中黑色素瘤的体内免疫治疗。（a）免疫治疗巨噬细胞缺失小鼠B16OVA肿瘤的疫苗接种方案；（b, c）第0天一次性皮下注射氯膦酸脂质体后巨噬细胞（b）和DC（c）的消除率；（d, e）分别免疫OVA、OVANPs或GluOVANPs后巨噬细胞缺失小鼠B16OVA肿瘤的平均（d）和个体（e）肿瘤生长曲线；（f）在DC缺失的Itgax-DTR转基因小鼠中治疗已建立的B16OVA肿瘤的疫苗接种方案；（g）腹腔注射DT对DCs的消耗，未治疗的小鼠作为对照；（h, i）分别免疫OVA、OVANPs或GluOVANPs后DC缺失小鼠B16OVA肿瘤的平均（h）和个体（i）肿瘤生长曲线

（7）GluNeoNVs用于肿瘤免疫治疗

该研究利用GluNeoNVs递送新抗原Adpgk，并与传统纳米疫苗（neonv）进行比较（图8a）。结果显示，GluNeoNVs（gluneonv）在肿瘤引流LNs中的积累明显高于其他疫苗，表明其在转移到LNs时最为有效（图8d）。不同疫苗处理后小鼠肿瘤的生长速度，结果表明neonv和gluneonv组的肿瘤生长速度较低，其中gluneonv组的肿瘤明显更小（图8f-g）。免疫分析进一步确认，GluNeoNVs能够显著增加分泌IFN-γ的CD8+ T细胞数量，增强了对肿瘤的免疫反应。这些结果表明，GluNeoNVs在新抗原递送和肿瘤免疫治疗中具有较好的应用前景。 

图8. 新抗原递送GluNeoNVs用于结肠肿瘤的免疫治疗。（a）示意图显示新抗原（Adpgk）、NeoNV和GluNeoNV，葡萄糖（红色三角形）被偶联到纳米疫苗的PEG外壳上；（b, c）DLS（b）和TEM（c）图像显示，NeoNV和GluNeoNV是单分散的，比例尺为50 nm；（d）Cy5标记Adpgk、Montanide+Poly(I:C)+Adpgk、NeoNV和GluNeoNV生物分布的定量结果；（e）治疗MC38结肠肿瘤的疫苗接种计划；（f, g）新抗原疫苗免疫小鼠MC38结肠肿瘤的平均（g）和个体（f）肿瘤生长曲线；（h, i）接种新抗原疫苗后脾脏中分泌IFN-γ的CD8+ T细胞的流式细胞术图（h）和定量测量（i）

研究小结：

该团队开发了一种多功能糖基化纳米疫苗方法，通过靶向动物和人类树突状细胞（DC）上高表达的Glut-1，实现了有效的抗原递送。与裸抗原和无糖基配体的常规纳米疫苗相比，这种糖基化纳米疫苗引发了更强的免疫应答，显著提高了抗肿瘤效果和生存率。研究表明，Glut-1是一个可靠的抗原递送靶点，因为它在各种类型的DC上广泛表达并且在DC激活过程中上调。有效的抗原递送能够增强免疫反应，尤其是在肿瘤治疗中表现出良好的效果。体内实验进一步验证了糖基化纳米疫苗通过DC的高选择性和有效性，为DC靶向抗原递送和免疫治疗提供了一个实用的方法。