IF:27.4 《AM》北大周永胜:两性离子三甲胺N-氧化物水凝胶调控糖尿病伤口再生中的免疫作用
专栏:学术前沿
发布日期:2024-09-18
作者:创赛科研

【研究背景】

在糖尿病伤口修复过程中,免疫系统的紊乱会导致持续的炎症和愈合延迟,最终形成慢性难愈合的伤口。中性粒细胞的主要功能包括吞噬、脱颗粒以及中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 的形成和释放。NET 是由颗粒蛋白修饰的染色质丝构成的网络结构。在正常伤口环境下,低浓度的 NET 促进表皮角质形成细胞的增殖。然而,糖尿病伤口中检测到过量的 NETs 生成,表明 NETs 在延缓伤口修复中起着重要作用。水凝胶作为一种前景广阔的伤口敷料材料,因其能够吸收渗出液并维持湿润的伤口环境而备受关注。两性离子水凝胶凭借其填充不规则深部伤口的能力,并具备抗生物感染和抵抗细菌附着的特性,吸引了广泛的研究兴趣。然而,关于两性离子水凝胶在糖尿病伤口中如何调节免疫微环境和细胞行为的机制,仍有待深入研究。


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针对上述问题,北京大学周永胜教授团队成功合成了一种新型聚两性离子三甲胺氮氧化物 (TMAO) 水凝胶 (PZ),并研究了其在调节糖尿病伤口愈合过程中的作用。他们将 PZ 水凝胶与聚阴离子水凝胶聚对苯乙烯磺酸钠 (PSS, PA) 和聚阳离子水凝胶聚甲基丙烯酸乙基三甲基氯化铵 (PMTAC, PC) 进行了比较,深入探讨了这些材料在糖尿病皮肤缺损中的修复效果及其免疫调节特性。通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 技术,研究团队绘制了不同电荷特性的 PA、PC 和 PZ 水凝胶周围的微环境,重点研究了巨噬细胞和中性粒细胞在伤口愈合中的关键作用。结果揭示了细胞簇的异质性、生物学功能及其相互作用,其中包括上调的 Ccl3+ 巨噬细胞和下调的 S100a9+ 中性粒细胞。此外,研究发现两性离子水凝胶能够抑制中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 的形成,并促进血管生成,从而加速糖尿病伤口的愈合。这项研究展示了两性离子 TMAO 水凝胶在促进糖尿病伤口愈合方面的独特作用,并在单细胞水平上阐明了其作用机制,为开发具有潜在转化应用的免疫靶向治疗策略提供了新思路。该文章于2024年6月17日以“Tracing Immunological Interaction in Trimethylamine N-Oxide Hydrogel-Derived Zwitterionic Microenvironment During Promoted Diabetic Wound Regeneration”为题发表于《Advanced Materials》(DOI: 10.1002/adma.202402738)。


(1)水凝胶敷料的合成与表征


为了研究聚合物链上的电荷如何影响伤口愈合过程,研究人员通过双网水凝胶合成法制备了三种具有不同电荷特性的水凝胶。如图1A所示,TMAO 单体是通过在 O₂ 气氛下使用 H₂O₂ 氧化 TMA 制得的。制备完成的水凝胶直接用于糖尿病小鼠的伤口敷料(图 1B)。在 3284 cm⁻¹处观察到的宽 FTIR 光谱带是由 GelMA 中的 -NH 伸缩振动引起的(图 1D)。此外,放大后的 400–2000 cm⁻¹ 区域(图 1E)显示红色曲线在 1690 cm⁻¹ 处的峰对应于 GelMA 中的 C═O 伸缩振动。这些特征峰在其他三种双网络水凝胶中也得到了验证,表明 GelMA 主导了水凝胶的骨架结构。如图1F所示,PZ 水凝胶同时含有正、负电荷基团,整体接近电中性,因此带电性最弱。这一结果与聚电解质的化学结构保持了较好的一致性。此外,图 1G 显示了水凝胶的模量,通常情况下,作为敷料的材料需要具有更柔软的特性,以便更好地贴合皮肤。PZ 由于其低模量,能够更好地与伤口表面接触,促进伤口的愈合。最后,PZ 水凝胶在图 1H 中展示了最低的脱水率,表明它能够在用作敷料时维持稳定的湿润环境,进一步支持其在伤口愈合中的应用。


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图1 水凝胶敷料的合成和特性A) 两性离子 TMAO 水凝胶 (PZ) 的合成流程。B) PZ 水凝胶的伤口敷料应用。C) 两性离子微环境内的免疫调节。D、E) GelMA、PA、PC 和 PZ 水凝胶的 FTIR 光谱。F) PA、PC 和 PZ 水凝胶的 Zeta 电位。G) GelMA、PA、PC 和 PZ 水凝胶的机械性能和 (H) 脱水速率


(2)两性离子水凝胶促进糖尿病伤口修复


如图2A所示,研究设计了测量糖尿病伤口愈合的方案,采用BKS-db/db小鼠作为II型糖尿病的模型,这些小鼠表现出病理性肥胖和持续性高血糖。将PA、PC和PZ水凝胶敷料应用于小鼠的伤口上,并拍摄了不同时间点的伤口愈合过程(第0天、第3天、第5天、第7天和第15天),如图2B所示。图2C重新展示了这些图片的对比效果。结果显示,所有组的伤口面积随着时间逐渐缩小,但在第3天、第5天、第7天和第15天,使用PZ水凝胶的糖尿病小鼠残留伤口面积显著小于PA和PC水凝胶组(图2D)。此外,研究还比较了不同水凝胶组别的肉芽组织厚度(图2E)。第7天时,PZ水凝胶处理组的糖尿病伤口肉芽组织厚度明显高于PA和PC组(图2F)。综合上述结果,PZ水凝胶在促进伤口愈合方面优于PA和PC水凝胶组。实验表明,这种新型仿生两性离子水凝胶(PZ水凝胶)在糖尿病伤口修复中具有显著的治疗效果,表现出更好的促进伤口愈合的性能。


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图2 PZ 水凝胶对糖尿病伤口愈合过程的评估A) 评估糖尿病伤口愈合的工作流程。B) 使用 PA、PC 和 PZ 水凝胶记录糖尿病伤口愈合过程。伤口大小为直径 1 厘米。C) 重新描述伤口愈合过程。D) 与 PA、PC 和 PZ 水凝胶组比较残留缺损面积。0、3、5、7 和 15 天,每组 n = 3 只小鼠。E) HE 分析显示,第七天不同治疗组的肉芽组织形成程度不同。比例尺 = 200 µm。F) 不同治疗组的肉芽组织厚度定量分析。每组n = 3 只小鼠。双尾t检验。数据为平均值 ± SD。p值通过单因素方差分析和 Tukey 事后检验计算得出。 *** p < 0.001,**** p < 0.0001


(3)单细胞图谱揭示两性离子水凝胶调节糖尿病微环境的异质性


为了探索两性离子水凝胶改善糖尿病伤口愈合的潜在机制,该研究团队使用单细胞 RNA 测序进行了深入分析。首先,在术后第3天和第7天,从PA、PC和PZ样本中提取细胞,经过过滤处理后,通过Seurat的无监督聚类,根据全局基因表达模式将细胞分类为多个簇。然后,这些簇被识别为主要的细胞类别,最终分类出11个细胞簇(图3A、B)。通过分析差异表达的基因特征,我们将各簇归类为其相应的细胞类型,并根据层次相似性进行了归属。图3A、C、D展示了每个簇的基因表达热图,细胞类型的总结见图3B。其中,簇C1细胞被归类为巨噬细胞,特征性地高表达Arg1、Cxcl1、Mmp9、S100a10(图3C)。簇C2主要为中性粒细胞,标志基因包括Stfa2l1、G0S2、Ngp和Retnlg(图3C)。簇C3细胞被归类为杯状细胞(约占2.39%),其特征性标志基因为Selenop(图3C)。研究表明,保持巨噬细胞和中性粒细胞之间的平衡对维持适当的炎症反应及伤口愈合至关重要。我们发现,在术后第3天和第7天,PA和PC水凝胶组的巨噬细胞(簇C1)和中性粒细胞(簇C2)比例较高,而PZ水凝胶组的比例适中(图3E、F)。这些结果表明,两性离子水凝胶能够有效调节糖尿病伤口愈合中的巨噬细胞和中性粒细胞比例,从而形成更平衡的免疫微环境,有助于促进伤口的修复。


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图3 scRNA-seq 分析揭示了第 3 天和第 7 天伤口的细胞异质性A) t-SNE 图揭示了细胞异质性,其中识别并颜色编码了 11 个不同的细胞簇。右侧定义了每个细胞簇的一般身份。B) 显示细胞库的伤口示意图。在 scRNA-seq 上识别的不同细胞类型用颜色编码以匹配 (A) 上的颜色。C) 选定簇特异性基因的表达分布特征图。每个细胞的表达水平都用颜色编码并叠加到 t-SNE 图上。表达水平最高的细胞被涂成红色。D) 基于高度可变基因的平均表达(相关距离度量、平均连锁)的所有糖尿病伤口细胞簇的无监督层次聚类热图。HSC:100547 造血干细胞;TA 细胞:过渡扩增细胞。E) 源自 (D) 的簇比例变化直方图。 F) 通过 t-SNE 投影可视化的 11 个簇的分布和比例;每个簇用颜色编码,巨噬细胞和中性粒细胞的比例标在旁边。


(4)两性离子水凝胶在糖尿病伤口中募集Ccl3+巨噬细胞


为了进一步揭示两性离子水凝胶在糖尿病伤口愈合过程中对巨噬细胞异质性的调节作用,该研究团队对伤后第3天和第7天的所有伤口巨噬细胞进行了无监督的重新聚类分析。结果显示,巨噬细胞分为7个亚簇(sC1至sC7,见图4A)。每个亚簇的特征性标记基因通过热图展示(图4B)。其中,sC1簇(Ccl3+)富含分泌型趋化因子,sC2簇(Slc7a2+)高表达M1样基因,sC3簇(Prdx1+)富含脂质代谢相关标志物,sC4簇(Col1a2+)为成纤维细胞样巨噬细胞,sC5簇(mt-Nd2+)与线粒体功能密切相关。通过伪时间排序和RNA速度分析,大多数巨噬细胞呈现一个主要轨迹,伴随五个小分叉(图4C)。进一步的研究发现,在伤后第3天和第7天,PZ水凝胶组中Ccl3+亚群的比例明显更高(图4D)。该研究团队还使用scEpath方法分析了PZ水凝胶组的伪时间动力学,识别了伪时间依赖性基因并将其分为6个基因簇(图4E)。在小提琴图中,PZ水凝胶组显示了Prok2、Cxcl1、Cdc42ep3、Cd63、Egr3、Slc4a3和Csf1在中性粒细胞趋化亚簇中的表达高于其他亚簇(图4F)。基于PZ水凝胶组sC1亚簇的GO富集分析结果(图4G),显示中性粒细胞趋化和趋化受体结合功能上调,而κB激酶/NF-κB活性下调(图4H)。在糖尿病小鼠的伤口边缘组织切片中,通过免疫荧光标记Egr3(红色)和Ccl3(绿色),结果表明作为Ccl3+亚簇的代表性标志物,Egr3和Ccl3在表皮和真皮中富集,并且在伤后第7天,PZ水凝胶组的表达水平显著高于PA和PC水凝胶组(图4I)。综上所述,这些结果表明,PZ水凝胶通过提高Ccl3+巨噬细胞亚簇的比例,促进了糖尿病伤口的修复,展现了其在调节免疫微环境中的独特优势。


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4 在两性离子水凝胶介导的微环境中识别巨噬细胞亚簇A) t-SNE 图显示巨噬细胞重新聚类,其中识别并颜色编码了七个不同的细胞亚簇。右侧定义了每个亚簇的一般身份。B) 巨噬细胞差异表达基因的热图。每个簇的选定基因都用颜色编码并显示在右侧。C) 根据附近细胞的未剪接和剪接转录本估计的巨噬细胞 RNA 速度,并在 t-SNE 投影上可视化;按簇进行颜色编码。D) 源自 (A) 的不同组的亚簇比例变化直方图。E) 对伪时间进行的 scEpath 分析确定了六个伪时间依赖性基因的基因簇(pC1 至 pC6)。左侧显示了所有分析的伤口巨噬细胞中所有差异表达基因的表达水平热图。右侧显示了所有六个簇中的平均基因表达动态和代表性基因。F) 从 (A) 生成的小提琴图显示了 PZ 水凝胶组中簇 sC1 的代表性基因。G) 列出了 PZ 水凝胶组中簇 sC1 上行基因的 GO 富集分析。H) 列出了 PZ 水凝胶组中簇 sC1 下行基因的 GO 富集分析。I) 选定标记物的 POD 7 伤口代表性共聚焦免疫荧光图像。比例尺 = 50 µm(上)、20 µm(下)。n = 3


(5)两性离子水凝胶抑制糖尿病伤口中的S100a9+中性粒细胞


为了进一步揭示两性离子水凝胶调节的微环境中中性粒细胞的异质性,我们对中性粒细胞进行了重新聚类,并在 t-SNE 图中将其分为6个亚组(sC1-sC6,见图5A)。每个亚组的代表性标记基因通过热图展示(图5B)。特别地,簇sC1(S100a9+)富含与中性粒细胞胞外陷阱(NETs)相关的基因;簇sC2根据Cxcl2、Il1b和Cd14的富集被归类为促炎亚群(Cxcl2+);簇sC3(G0s2+)为脂质代谢相关亚群;簇sC4细胞(Tmsb4x+)参与细胞间信号转导;而簇sC5(Stfa2l1+)与细胞外基质(ECM)重塑高度相关。通过RNA速度分析(图5C)和轨迹分析(图5E、F),发现S100a9+亚簇在伪时间分布中位于前端,表明其在NETs形成中的关键作用。值得注意的是,与PA和PC水凝胶组相比,PZ水凝胶组中S100a9+中性粒细胞(sC1)的比例最小(图5D),表明PZ水凝胶有效抑制了NETs的过度形成。接下来,团队进一步分析了PZ水凝胶组中NETs标记基因的动态表达模式,结果表明S100a8/a9的表达主要集中在伪时间轨迹的早期,并在后期逐渐减少,而Slpi的表达在伪时间轨迹末端显著增加(图5G)。此外,PZ水凝胶中S100a9+中性粒细胞的GO富集分析显示,与细胞外基质组织、抑制Il1α分泌和金属肽酶活性相关的基因被上调,而NF-κB信号、C型受体信号以及糖尿病中AGE-RAGE信号通路被下调(图5H、I)。这些结果与单细胞RNA测序的观察结果一致,进一步支持了两性离子水凝胶在抑制NETs相关炎症和促进糖尿病伤口修复中的重要作用。总体而言,这些数据表明,两性离子水凝胶通过减少NETs的形成和缓解炎症失调,有助于加速糖尿病伤口的愈合。


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图5 在两性离子水凝胶调节的微环境中识别中性粒细胞亚簇。A) t-SNE 图显示中性粒细胞重新聚类,其中识别出六个不同的细胞亚簇并用颜色编码。右侧定义了每个亚簇的一般身份。B) 中性粒细胞差异表达基因的热图。每个簇的选定基因用颜色编码并显示在右侧。C) 根据附近细胞的未剪接和剪接转录本估计的巨噬细胞 RNA 速度,并在 t-SNE 投影上可视化;按簇进行颜色编码。D) 源自 (A) 的不同组的亚簇比例变化直方图。E、F) 伪时间谱系轨迹分析展示了中性粒细胞之间的亚簇关系 (E),按亚簇进行颜色编码 (F)。 G)伪时间上S100a8、S100a9、Spp1和Spli表达分布的特征图。这两个基因都是 NETs 亚簇的一部分。每个细胞的表达水平用颜色编码,最高表达水平为红色。H)列出了 PZ 水凝胶组中S100a9+亚簇上调基因的 GO 富集分析。I) 列出了 PZ 水凝胶组中S100a9+亚簇下调基因的 GO 富集分析。J) 所选标记物的 POD 7 伤口代表性共聚焦免疫荧光图像。比例尺 = 50 µm(上)、20 µm(下)。n = 3


(6)两性离子水凝胶促进糖尿病伤口愈合中巨噬细胞和中性粒细胞之间的相互作用


该团队使用了CellChat分析技术来探讨免疫细胞,主要是巨噬细胞和中性粒细胞之间的细胞间通讯模式。通过三个圆圈图分别展示了PA水凝胶(图6A)、PC水凝胶(图6B)和PZ水凝胶组(图6C)中配体-受体的相互作用数量和强度。结果显示,在PA、PC和PZ组中,Ccl3+巨噬细胞的圈大小最大,而S100a9+中性粒细胞的圈最小,这与图4D和图5D的结果一致。尤其是在PZ组中,Ccl3+巨噬细胞和S100a9+中性粒细胞之间的通讯网络更加紧密,表明巨噬细胞-中性粒细胞的相互作用在糖尿病伤口中起到了主导作用。进一步分析发现,PZ组中S100a9+中性粒细胞与巨噬细胞亚群之间的相互作用通过Spp1 –(Itgα5+Itgβ1)结合而减弱(图6D,E)。在第7天(POD 7)通过免疫荧光染色证实了这一潜在的通讯模式。结果显示,与PA和PC组相比,PZ组中Spp1和Itgβ1的共表达显著减少(图6F)。这些结果表明,PZ水凝胶不仅在调节巨噬细胞和中性粒细胞的相互作用中发挥了重要作用,还通过调控Spp1 –(Itgα5+Itgβ1)信号通路进一步促进了糖尿病伤口的愈合。


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图6 巨噬细胞和中性粒细胞之间的细胞通讯景观A–C) 使用 CellChat 比较 PA (A)、PC (B) 和 PZ 组 (C) 中巨噬细胞和中性粒细胞的整体细胞间相互作用强度。D) PA-PZ 组中S100a9+中性粒细胞 (Neu-1) 和巨噬细胞亚群 (Mac-1、Mac-2、Mac-7 和 Mac-3) 之间的特异性配体-受体对。E) PC-PZ 组中S100a9+中性粒细胞 (Neu-1) 和巨噬细胞亚群 (Mac-1、Mac-2、Mac-7 和 Mac-3) 之间的特异性配体-受体对。F) 所选标记物的 POD 7 伤口代表性共聚焦免疫荧光图像。比例尺 = 50 µm(上),20 µm(下)。n = 3


(7)两性离子水凝胶通过抑制 NET 形成和改善血管生成来促进糖尿病伤口愈合


该研究团队测量了PA、PC和PZ水凝胶,以及皮下注射重组小鼠SPP1(rmSpp1)对小鼠糖尿病皮肤缺损的治疗效果。不同组别的伤口修复过程如图7B所示,并在图7C中总结了残留缺损面积的变化情况。结果显示,注射rmSpp1显著上调了残留伤口面积,但使用PZ水凝胶的小鼠,其残留缺损面积百分比显著低于PA和PC组。在三组注射rmSpp1的组别中,PZ水凝胶组在术后7天的残留伤口面积仍然最小(图7D)。此外,免疫荧光染色结果显示,与PA和PC水凝胶组相比,术后7天用PZ水凝胶治疗的伤口中,Cit-H3和MPO的共表达显著减少,表明NETs形成较少。虽然注射rmSpp1显著促进了PA、PC和PZ组中的NETs形成,但PZ组仍然显示最少的Cit-H3和MPO共表达(图7E)。这些结果表明,PZ水凝胶在减少NETs形成和促进糖尿病伤口愈合方面具有更好的效果,即使在注射rmSpp1的情况下依然表现出较强的抑制作用。


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图7 评估用 PA、PC 和 PZ 水凝胶治疗的糖尿病伤口愈合情况以及施用 rmSpp1 的情况。A) 评估不同组别糖尿病伤口愈合情况的实验方案。B) 使用 PA、PC 和 PZ 水凝胶记录糖尿病伤口愈合过程。伤口大小为直径 1 cm。C) 重新描述伤口愈合过程。D) 比较使用 PA、PC 和 PZ 水凝胶和 rmSpp1 后残留缺损面积。每组n = 3 只小鼠,时间为 0、3、5 和 7 天。E) 术后 7 天糖尿病伤口 NETs 区域的代表性共聚焦图像。MPO ,红色;Cit-H3,绿色;DAPI,蓝色。比例尺 = 50 µm(上),20 µm(下)。n = 3。数据为平均值 ± SD。p值采用单因素方差分析和 Tukey 事后检验计算。 * p < 0.05,** p < 0.01


【研究小结】


受氧化三甲胺 (TMAO) 启发,该团队通过双网水凝胶合成法制备了一种新型两性离子水凝胶。与聚阴离子和聚阳离子水凝胶相比,这种水凝胶能够显著加速糖尿病伤口的愈合。为全面了解其在糖尿病伤口修复中的免疫调节作用,团队利用单细胞测序技术,绘制了具有不同电荷特性的微环境中的多细胞异质性概况。值得注意的是,研究阐明了巨噬细胞和中性粒细胞的异质性,发现两性离子水凝胶在缓解糖尿病微环境中失调的巨噬细胞和中性粒细胞方面发挥了关键作用。具体而言,与聚阴离子和聚阳离子水凝胶相比,两性离子水凝胶显著上调了Ccl3+巨噬细胞,且下调了S100a9+中性粒细胞的比例,从而有效促进了糖尿病伤口的愈合。此外,该水凝胶还能够抑制中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的形成,并促进血管生成,加速了愈合过程。这项研究不仅揭示了两性离子微环境在糖尿病伤口修复中的多细胞异质性,还为开发新型靶向免疫调节材料提供了有前景的设计平台,有望为糖尿病伤口治疗带来新的突破。

 

原文链接:https://doi.org/10.1002/adma.202402738

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