【研究背景】

溃疡性结肠炎（UC），也被称为炎症性肠病（IBD），是一种常见的胃肠道炎症疾病。近年来，该病的发病率和相关死亡率显著上升。UC主要表现为结肠的反复炎症，目前的治疗方法主要是通过口服抗炎药物来减轻炎症。然而，这些药物的有效性受限于药物在炎症结肠中的靶向和滞留不足、黏液屏障的渗透受限，以及炎性细胞因子的过量产生。研究人员开发了多种纳米颗粒（NPs）作为药物递送载体，尽管这些纳米药物能够在特定条件下释放药物并减轻结肠炎，但其在结肠炎组织中的滞留时间和屏障渗透能力仍然有限。为了改善这些问题，最近开发了化学或生化驱动的微/纳米马达，用于增强胃肠道炎症性疾病的治疗。此外，巨噬细胞纳米海绵被发现可以有效吸附炎性分子，展示了优于单一抗体的广谱生物中和能力。

针对上述问题，澳门大学中药质量研究国家重点实验室王瑞兵团队开发了一种创新的口服给药系统，使用M2巨噬细胞膜包裹的Janus纳米马达（Motor@M2M），并将其嵌入海藻酸钠水凝胶微球（SAM）中。这种系统在胃环境中保护纳米马达，并在肠道中释放，增强了纳米马达对炎症结肠的靶向递送效率，最终减轻结肠上皮细胞的凋亡。在小鼠模型中，这种系统展示了显著的治疗效果，包括减轻炎症、中和ROS、恢复肠道屏障功能和调节肠道微生物群。相关研究在2024年6月28日以“Oral microsphere formulation of M2 macrophage-mimetic Janus nanomotor for targeted therapy of ulcerative colitis”为题发表于《Science Advances》（DOI: 10.1126/sciadv.ado6798）。

图1 Motor@M2M@SAM制剂示意图及其用于UC治疗的机制

（1）IL-4诱导的M2巨噬细胞膜作为纳米海绵具有效中和炎症因子的潜力

在IL-4刺激下，M2组的细胞膜表面炎症因子受体表达显著高于M1和M0组。特别是TNF-α (TNFR1)、IL-6 (IL-6R)和IFN-γ (IFNGR1)的受体（如图2，A和B所示）。酶联免疫吸附实验（ELISA）结果显示，M2组巨噬细胞膜在中和炎症因子（包括TNF-α和IL-6）方面表现出更强的能力，作为纳米海绵在中和炎症因子方面具有显著的优势。采用Pickering乳液法在介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）表面非对称涂覆MnO₂，形成Janus电机（Motor）。通过挤出法将IL-4诱导的RAW 264.7细胞衍生的M2巨噬细胞膜（M2M）涂覆在Motor表面，成功制备了Motor@M2M。涂覆M2M后，Motor@M2M的水动力学尺寸从约152 nm增加到约169 nm，且其ζ电位比Motor更负，这归因于M2M表面的强负电位。考马斯亮蓝染色分析显示，Motor@M2M的蛋白质带与分离的M2M相似，进一步表明M2M涂层的成功。在催化性能测试中，Motor和Motor@M2M在30分钟内分别分解了54.5%和55.5%的H₂O₂。两者在10分钟内催化生成了相似量的O₂（分别为17.5 mg/L和17.04 mg/L），表明M2M涂层不会影响氧气的生成量。这些结果表明，Motor@M2M纳米结构的成功制备及其稳定性和功能性能，为炎症因子的中和提供了一种有效的新型方法。

图2 Motor@M2M的特征及其运动行为

（2）H₂O₂驱动的Motor@M2M在抗氧化应激和炎症环境中表现出优异的ROS清除能力

研究人员通过Nanosight NS500记录了Motor@M2M在模拟结肠液中的自主运动，发现其运动轨迹随着H₂O₂浓度的增加而增强。使用ImageJ分析发现，Motor@M2M和Motor在高浓度H₂O₂环境下运动方向性更强，而对称结构的MnO₂@M2M和MnO₂运动方向较为随机。数据表明，Motor@M2M的运动距离从0.0 mM H₂O₂溶液中的43.1 μm增加到10 mM H₂O₂溶液中的179 μm，其平均速度达到17.9 μm/s，比对称结构纳米粒子高出约1.5倍。进一步研究表明，Motor@M2M在H₂O₂丰富的炎症微环境中通过消耗大量H₂O₂显著降低ROS水平，从而缓解组织缺氧状态。流式细胞术结果显示，Motor@M2M在降低ROS表达方面具有显著效果，并能上调抗炎性M2巨噬细胞标志物（CD206），促进巨噬细胞从M1型向M2型的极化。此外，Motor@M2M通过减少ROS对结肠上皮细胞的毒性，显著降低细胞凋亡率，显示出优越的抗氧化应激能力。这些发现表明，Motor@M2M在结肠炎症治疗中具有潜在应用价值。

图3 Motor@M2M通过产氧对促炎性巨噬细胞极化和NCM460细胞凋亡的缓解作用

（3）M2M在Motor@M2M中的炎症靶向和中和能力显著

在溃疡性结肠炎（UC）中，M2巨噬细胞纳米海绵表面的特定分子能够与炎症微环境中的受体结合。通过研究M2巨噬细胞纳米海绵上淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）和晚期抗原4（VLA-4）的表达，以及巨噬细胞和结肠上皮细胞上相应受体（ICAM-1和VCAM-1）的表达，验证了其炎症靶向能力。结果显示，LFA-1和VLA-4在M2巨噬细胞纳米海绵中高表达，而在M0和M1巨噬细胞膜中表达显著降低。相应的受体ICAM-1和VCAM-1在炎症细胞（LPS诱导的RAW 264.7和NCM460细胞）中高表达。流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结果显示Motor@M2M在LPS诱导的炎症细胞膜上表现出强荧光，表明M2巨噬细胞纳米海绵表面的特定蛋白质能够轻松与炎症细胞中的受体结合。与之对比，未经LPS刺激的RAW 264.7和NCM460细胞中，Motor@M2M和Motor表现出较弱的荧光。ELISA实验表明，PLGA@M2M和Motor@M2M处理后的RAW 264.7和NCM460细胞中，代表性炎症因子IL-6和TNF-α的分泌量显著降低。这些结果表明，M2巨噬细胞纳米海绵与炎症巨噬细胞和结肠上皮细胞之间存在强分子识别能力，Motor@M2M可以通过表面受体被受体细胞捕获，靶向炎症部位并中和炎症因子。

图4 Motor@M2M 表面的 M2M 发挥巨噬细胞样载体作用，用于靶向炎症，并发挥纳米海绵作用，用于中和炎症

（4）Motor@M2M@SAM在炎症结肠中的靶向递送和肠道屏障穿透能力显著

研究人员通过微流控方法制备了Motor@M2M钠藻酸盐微球（简称Motor@M2M@SAM），以确保M2M在胃肠道中的功能蛋白稳定。研究显示，Motor@M2M@SAM在胃液环境中48小时内形态稳定，而在结肠液中快速膨胀并在12小时内出现大量裂纹，24小时内破裂成碎片，48小时内完全降解，表明其具有结肠靶向释放能力。通过口服给药的小鼠模型验证了Motor@M2M@SAM的靶向递送能力。在摄取Cy5标记的Motor@M2M@SAM 24小时后，小鼠结肠中荧光强度显著高于对照组，48小时后进一步增强，表明Motor@M2M@SAM能够有效到达结肠炎症部位并释放。定量分析结果显示，Motor@M2M@SAM组小鼠结肠中锰含量（Mn）显著高于其他组别，表明其具有较强的结肠靶向递送能力。此外，冷冻切片实验和共聚焦显微镜分析表明，Motor@M2M@SAM能够深入穿透炎症组织和肠道屏障，显示出优异的靶向和渗透性能。体外实验进一步证明，在H2O2存在下，Motor@M2M和Motor显著增强了黏液层的穿透能力。这些数据表明，具有Janus结构的Motor@M2M凭借自推进特性能够有效穿透黏液层，结合M2巨噬细胞纳米海绵的炎症靶向能力，使Motor@M2M@SAM系统在溃疡性结肠炎的靶向治疗中表现出极大潜力。

图5 M2M增强了Motor@M2M@SAM在炎症结肠中的滞留，并且H 22驱动的运动加深了肠道屏障的渗透

（5）Motor@M2M@SAM在DSS诱导的结肠炎中的治疗效果显著

研究人员在急性溃疡性结肠炎（UC）模型中验证了Motor@M2M@SAM的治疗效果。与SAM、PLGA@M2M@SAM、Motor@SAM和MnO2@M2M@SAM组相比，Motor@M2M@SAM显著降低了疾病活动指数（DAI）并抑制了UC小鼠的体重下降。治疗结束时，Motor@M2M@SAM组的小鼠几乎没有出现明显的便血现象。内镜图像显示，Model和SAM组的小鼠结肠内有明显出血和溃疡，而Motor@M2M@SAM组的小鼠结肠内溃疡显著减少，内壁接近正常小鼠状态。治疗10天后，Motor@M2M@SAM组小鼠的结肠长度显著长于其他组，表明其能够抑制DSS引起的典型结肠缩短现象。组织学染色结果显示，Motor@M2M@SAM治疗有助于维持结肠上皮的完整性，减少炎症细胞的浸润，缓解结肠炎症症状。进一步研究表明，Motor@M2M@SAM通过驱动巨噬细胞从M1型向M2型极化，重塑免疫稳态并发挥抗炎效果。免疫荧光染色显示，Motor@M2M@SAM治疗组的CD86+ M1型巨噬细胞减少，CD206+ M2型巨噬细胞增加。流式细胞术结果也证实了这一点，Motor@M2M@SAM组的M2型巨噬细胞比例显著增加，M1型巨噬细胞比例显著减少。氧化应激水平检测显示，Motor@M2M@SAM组小鼠结肠组织中的ROS水平显著降低，表明其能够有效减少炎症部位的氧化应激。TUNEL染色结果显示，Motor@M2M@SAM治疗显著减少了结肠区域的细胞凋亡。此外，Motor@M2M@SAM显著提高了结肠紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达水平，有助于恢复肠上皮屏障的完整性。最终，口服给药后的体内毒性评估显示，各组小鼠的酶活性和主要器官组织学评估没有显著差异，表明Motor@M2M@SAM具有良好的安全性。这些结果表明，Motor@M2M@SAM在治疗DSS诱导的结肠炎中表现出显著的治疗效果和安全性，具有潜在的临床应用价值。

图6 Motor@M2M@SAM 显著减轻了DSS诱发的结肠炎炎症症状

（6）Motor@M2M@SAM在调节DSS诱导的结肠炎小鼠肠道微生物群方面表现出显著效果

研究人员通过16S rRNA基因扩增子测序分析了Motor@M2M@SAM对肠道微生物群的调节作用。α多样性分析显示，与正常组和Motor@M2M@SAM组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠在物种多样性和丰度方面存在显著差异。线性判别分析（LDA）效应大小分析表明，不同处理组之间的细菌群落组成存在明显差异。实验结果显示，DSS处理组的微生物群落组成与正常组和Motor@M2M@SAM处理组显著不同。非度量多维尺度（NMDS）图进一步证实，DSS诱导的结肠炎小鼠与健康小鼠在肠道微生物群方面明显分离，而Motor@M2M@SAM处理组的肠道微生物群组成更接近正常小鼠。Venn图展示了三组肠道菌群的共有和独特物种。进一步分析显示，在门和属水平上，Normal组和Motor@M2M@SAM组的肠道菌群组成具有高度相似性。定量分析表明，Motor@M2M@SAM有效增加了拟杆菌门（Bacteroidota）的比例，对厚壁菌门（Firmicutes）无显著影响。Motor@M2M@SAM还能有效抑制与IBD病程相关的变形菌门（Proteobacteria）的丰度。在属水平上，Motor@M2M@SAM显著提高了Muribaculaceae家族未命名属、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和臭杆菌属（Odoribacter）（有益细菌）的相对丰度，并显著降低了促进IBD进展的致病菌志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度。这些变化表明，Motor@M2M@SAM具有良好的肠道微生物群调节能力，可以优化UC小鼠的肠道微生物群组成。

图7 Motor@M2M@SAM 恢复 DSS 诱发的 IBD 小鼠的肠道菌群稳态

【研究小结】

本研究介绍了一种无需分子药物的创新治疗溃疡性结肠炎（UC）方法。该策略开发了一种Janus纳米马达系统——Motor@M2M，采用M2巨噬细胞膜（M2Ms）包被，并嵌入钠藻酸盐水凝胶微球（SAM）中，用于口服治疗UC。这一创新系统在体内和体外实验中均显示出良好的效果。在体外实验中，M2Ms有效中和了炎症因子，且随着H₂O₂浓度的增加，Motor@M2M在黏液屏障中的扩散速度也随之增加。此外，Motor@M2M通过分解H₂O₂生成氧气泡，缓解缺氧，清除活性氧（ROS），从而促使巨噬细胞从M1型向M2型重新极化，并减少结肠上皮细胞的凋亡。M2Ms作为诱饵，通过其表面的特定蛋白质中和炎症细胞中的细胞因子。在体内研究中，SAM系统在胃内表现出良好的耐受性，在肠道释放包裹的Motor@M2M。生物分布研究显示，得益于M2M包被和Motor@M2M的自推进能力，该系统在炎症部位的靶向性和黏液屏障的穿透能力显著增强。Motor@M2M@SAM在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中显著缓解了UC症状，减少了肠道炎症，重新极化巨噬细胞，清除ROS，恢复肠道屏障和菌群。然而，研究也指出了几项局限性，包括MnO₂纳米材料尚未获得FDA批准、实验仅对急性UC模型进行了短期评价，以及在GMP生产中膜包被质量控制和定量分析的挑战。尽管如此，本研究引入了一种针对UC的口服Motor@M2M@SAM制剂，不需要传统的分子药物治疗，展示了其在临床转化中的巨大潜力，并为进一步研究提供了新的方向。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado6798