针对上述问题，华南理工大学袁友永团队构建了一种可吸入、双重响应的纳米"鸡尾酒"（nanococktail）系统，实现分室特异性的蛋白降解。该体系包含两种生物标志物响应型纳米颗粒：GAL@SD encapsulates STING降解剂（SD），由衰老细胞中高表达的SA-β-Gal触发，在衰老上皮细胞内精准释放；FAP@BD递送BRD4降解剂（BD），经纤维化区域富集的FAP-α切割后，优先作用于活化成纤维细胞富集区。该酶响应PROTAC递送系统可在各自疾病微环境中实现空间精确、细胞类型局限的双靶点降解，同时瓦解上皮细胞的衰老相关分泌表型（SASP）和成纤维细胞的促纤维化转录程序，从而在体内外协同打断自我维持的纤维化环路。该研究不仅建立了一个疗效更优的细胞特异性双PROTAC平台，也为其他由异常多细胞串扰驱动的复杂疾病提供了可推广的靶向治疗框架。该文章于2026年6月24日以《Inhalable Polymeric PROTAC Nanococktail for Targeted Protein Degradation in Idiopathic Pulmonary Fibrosis》为题发表于《Journal of the American Chemical Society》（DOI: 10.1021/jacs.6c09336）。

图1.用于特发性肺纤维化治疗的吸入式酶响应纳米颗粒示意图。（A）双重酶响应纳米颗粒的设计：GAL-PBC-PEG与FAP-PBC-PEG自组装形成纳米颗粒，分别携带响应SA-β-Gal和FAP-α的连接子，并包载不同PROTAC货物——GAL@SD递送STING降解剂（SD），FAP@BD递送BRD4降解剂（BD），实现 diseased 肺微环境中两个促纤维化信号调控因子的互补降解；（B）吸入后纳米颗粒穿透气道黏液并蓄积于纤维化肺病灶：在SA-β-Gal活性升高的区域，GAL@SD释放SD，减轻上皮损伤区STING相关的衰老与炎症信号；在FAP-α富集的成纤维细胞区域，FAP@BD释放BD，通过降解BRD4抑制成纤维细胞活化和细胞外基质生成，二者协同阻断上皮衰老炎症与成纤维细胞驱动的基质重塑，从而缓解肺纤维化。

（1）人类特发性肺纤维化（IPF）中 STING 介导的上皮细胞衰老与 BRD4 驱动的成纤维细胞活化

为明确STING和BRD4在IPF肺组织不同细胞区室中的表达，采用SFTPC标记肺泡上皮区域，并结合H&E形态排除炎症细胞。与健康对照相比，IPF肺组织中肺泡上皮细胞Ki-67阳性率明显降低，而p21阳性细胞显著增加，提示肺泡上皮呈低增殖、衰老相关表型，而非过度增殖（图2A、C、D）。在对应的纤维化区域，STING表达明显升高，并与p21富集区域呈空间相关性，表明上皮重塑可能伴随STING相关衰老信号激活（图2A、E）。同时，IPF肺组织中Vimentin表达增强，α-SMA阳性肌成纤维细胞区域扩大，提示间质重塑和成纤维细胞活化加重（图2B、F）；BRD4在上述重塑区域显著富集，其阳性细胞数量较健康对照明显增加（图2B、G）。结果表明，IPF肺组织同时存在STING相关的p21高表达/Ki-67低表达肺泡上皮表型，以及BRD4高表达的活化成纤维细胞表型，为进一步研究上皮STING信号与成纤维细胞BRD4活性在肺纤维化中的作用提供了组织病理学依据。

图2. 人IPF肺组织的免疫组化表征。（A）健康对照与IPF患者肺组织中SFTPC、Ki67、p21和STING的代表性IHC图像；（B）同一队列中Vimentin、α-SMA和BRD4的代表性IHC图像；（C–G）形态学鉴定的肺泡上皮细胞中Ki-67阳性细胞（C）、p21阳性细胞（D）、STING阳性细胞（E）、α-SMA阳性细胞（F）和BRD4阳性细胞（G）的定量分析。

（2）SD 通过抑制 cGAS-STING 通路减轻博来霉素（BLM）诱导的肺泡上皮细胞衰老

为构建IPF相关肺泡上皮细胞衰老模型，采用BLM刺激MLE-12细胞。BLM以浓度依赖性方式上调p21和p16表达（图3A），增加SA-β-Gal阳性细胞比例（图3B、C），并降低EdU阳性率，表明细胞增殖受抑并发生生长停滞（图3D、E）。机制研究显示，BLM上调STING表达，而SD促进BLM刺激条件下的STING降解，并降低STING磷酸化及NF-κB活化水平，表明STING–NF-κB炎症信号受到抑制（图3F–H）。CRBN抑制剂或蛋白酶体抑制剂MG-132均可阻断SD介导的STING下调，提示SD通过募集CRBN并依赖蛋白酶体途径促进STING降解。此外，BLM显著增加IL-6、IL-1β和TGF-β1等衰老相关分泌表型因子的释放，而SD可降低其分泌水平，但未使其完全恢复至对照水平，提示SD主要减弱BLM诱导的SASP，而非完全逆转细胞衰老（图3I–K）。免疫荧光和Western blot结果进一步显示，BLM上调Vimentin并下调E-cadherin，而SD可部分逆转上述变化，减轻衰老肺泡上皮细胞的EMT样纤维化表型（图3L–N）。综上，SD可通过CRBN–蛋白酶体途径促进STING降解，抑制STING–NF-κB信号、炎症性SASP释放及EMT样表型，发挥STING靶向的衰老表型调节作用。

图3. SD通过促进STING降解减轻BLM诱导的MLE-12细胞衰老、炎症激活及EMT样纤维化表型。（A）递增浓度BLM处理的MLE-12细胞中p21和p16表达的Western blot分析；（B、C）BLM处理后SA-β-Gal染色的代表性图像及SA-β-Gal阳性细胞定量，比例尺150 μm；（D、E）BLM处理后EdU染色的代表性图像及EdU阳性细胞定量，比例尺50 μm；（F）SD处理后BLM（50 μg/mL）处理的MLE-12细胞中STING表达的Western blot分析；（G、H）有或无SD存在时BLM（50 μg/mL）处理的MLE-12细胞中NF-κB、p-STING和STING表达的Western blot分析及定量；（I–K）培养上清中IL-6、IL-1β和TGF-β1水平的ELISA分析；（L、M）Vimentin和E-cadherin表达的代表性免疫荧光图像，比例尺100 μm；（N）BLM（50 μg/mL）和/或SD处理后E-cadherin和Vimentin表达的Western blot分析。

（3）BD 通过降解 BRD4 抑制成纤维细胞的活化与迁移

为构建肺成纤维细胞活化模型，采用不同浓度TGF-β1刺激MLFs。TGF-β1以浓度依赖性方式上调BRD4和α-SMA表达；10 ng/mL TGF-β1可显著增加FAP-α荧光信号，继续提高至20–30 ng/mL未产生进一步显著变化，因此后续实验采用10 ng/mL TGF-β1。细胞活力检测显示，BD浓度不超过1 μM且处理48 h时，MLFs存活率维持在80%以上，而更高浓度可降低细胞活力，因此选择0.001–1 μM进行BRD4降解分析，并采用0.1和1 μM开展功能实验。在TGF-β1刺激下，BD以浓度依赖性方式促进BRD4降解，其中1 μM作用最明显（图4A）；CRBN抑制剂或蛋白酶体抑制剂MG132可部分恢复BRD4表达，二者联合处理的恢复作用进一步增强，表明BD主要通过CRBN和蛋白酶体依赖途径诱导BRD4降解。功能检测显示，BD降低TGF-β1诱导的Collagen I和α-SMA表达，并减少二者的细胞内积累，其中1 μM BD的抑制作用最显著（图4B、H–K）。Transwell和划痕实验进一步表明，BD以浓度依赖性方式抑制TGF-β1诱导的MLFs迁移及划痕闭合，1 μM时作用最强（图4C–G）。此外，BLM损伤的MLE-12细胞条件培养基可上调MLFs中Collagen I和α-SMA表达，而SD处理后的条件培养基可减弱上述变化，提示上皮细胞STING降解能够通过调节旁分泌信号抑制成纤维细胞活化。综上，BD通过促进BRD4降解抑制成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化和迁移，SD则降低损伤上皮细胞分泌组的促纤维化作用，从而协同干预上皮细胞–成纤维细胞之间的促纤维化串扰。

图4. BD通过降解BRD4抑制成纤维细胞活化和迁移。（A）TGF-β1（10 ng/mL）刺激下BD处理的MLF中BRD4蛋白水平的Western blot分析；（B）TGF-β1（10 ng/mL）刺激下，载体、0.1 μM BD或1 μM BD处理的MLF中collagen I和α-SMA表达的Western blot分析；（C）Transwell实验中迁移MLF的代表性图像，比例尺100 μm；（D）Transwell迁移实验示意图；（E）迁移MLF的定量分析；（F）划痕实验中伤口闭合率的定量分析；（G）0和24 h时划痕的代表性图像，比例尺400 μm；（H、J）MLF中α-SMA的代表性免疫荧光图像及定量，比例尺100 μm；（I、K）MLF中collagen I的代表性免疫荧光图像及定量，比例尺100 μm。

（4）吸入型纳米粒子的表征与黏液穿透性能

分子动力学模拟显示，GAL@SD和FAP@BD在100 ns内形成稳定聚集体，而PLGA-PEG对照体系仍存在结构波动（图5A、B）；回转半径、溶剂可及表面积和结合自由能分析进一步表明，GAL@SD和FAP@BD形成了更紧密、稳定的纳米组装体，其组装主要由π–π堆积驱动，并由氢键进一步稳定。单颗粒追踪显示，GAL@SD和FAP@BD在黏蛋白网络中的运动范围更广，均方位移明显增加（图5C、D）；GAL@SD的有效扩散系数为PLGA-PEG@SD的2.12倍，FAP@BD则为PLGA-PEG@BD的1.57倍（图5E）。在0.3%和0.5%黏蛋白条件下，GAL@SD及FAP@BD形成的颗粒–黏蛋白聚集体荧光强度分别约为相应PLGA-PEG制剂的1/5和1/4，表明其黏蛋白吸附减少（图5F）；三维共聚焦成像进一步证实两种酶响应颗粒能够更深地穿透人工黏液层（图5G）。在Transwell黏液屏障模型中（图5H），GAL@SD穿透黏液后在MLE-12细胞中的摄取率达到51.5%，显著高于PLGA-PEG@SD的14.1%（图5I、L）；FAP@BD在MLFs中的摄取率达到52.8%，显著高于PLGA-PEG@BD的4.3%（图5J、K）。上述结果表明，GAL@SD和FAP@BD具有稳定的组装结构、较低的黏蛋白结合能力、较强的黏液穿透性能及较高的靶细胞摄取效率，可满足肺部吸入递送和细胞选择性释药需求。

图5. 可吸入纳米颗粒的表征及黏液穿透性能。（A，B）GAL@SD（A）和FAP@BD（B）的分子动力学模拟，其中青色、紫色、浅粉色和浅绿色分别代表GAL-PBC-PEG、SD、FAP-PBC-PEG和BD；（C）PLGA-PEG@SD、PLGA-PEG@BD、GAL@SD和FAP@BD在黏蛋白中的运动轨迹，标尺：1 μm；（D）不同纳米颗粒在黏蛋白中的均方位移（MSD，n=3）；（E）不同纳米颗粒在黏液中的有效扩散系数分布（n=5，mean ± SD）；（F）不同浓度黏蛋白（0.3%或0.5%，w/v）中Cy5标记纳米颗粒聚集体的荧光强度（n=3）；（G）纳米颗粒穿透人工黏液层的三维CLSM图像；（H）纳米颗粒穿过PBS或黏液层后被上皮细胞摄取的Transwell模型示意图；（I，J）纳米颗粒经PBS或黏液层处理4 h后，下室MLE-12细胞（I）和MLFs（J）摄取的代表性流式细胞术图；（K，L）PLGA-PEG@BD与FAP@BD（K）以及PLGA-PEG@SD与GAL@SD（L）穿透黏液后细胞内化的代表性免疫荧光图像，标尺：200 μm。

（5）吸入纳米颗粒的稳定性、响应性及肺部生物分布

药物释放实验进一步显示，GAL@SD和FAP@BD分别在β-Gal和FAP-α作用下呈时间依赖性释放SD和BD（图6A、B）。以尼罗红作为荧光报告分子监测细胞内颗粒解体和载荷释放（图6C），结果显示，FAP@BD_NR在TGF-β1活化的MLFs中较PLGA-PEG@BD_NR表现出更快的荧光衰减，GAL@SD_NR在BLM诱导的衰老MLE-12细胞中也较PLGA-PEG@SD_NR表现出更快的荧光衰减，分别证实FAP-α和SA-β-Gal介导的细胞响应性释放（图6D–G）。功能检测显示，GAL@SD显著降低衰老MLE-12细胞中的STING表达，其降解效果强于PLGA-PEG@SD（图6H、I）；FAP@BD则显著降低活化MLFs中的BRD4表达，并同步下调α-SMA和Collagen I（图6J–M）。在肺纤维化小鼠中，Cy5标记颗粒的活体及离体荧光成像显示，吸入GAL@SD或FAP@BD后肺部荧光信号和滞留水平高于相应PLGA-PEG制剂（图6N、O）；肺组织共聚焦成像进一步显示，两种酶响应颗粒在纤维化肺组织中的分布更广泛、均匀。给药24 h后对肺细胞群进行流式细胞术分析，GAL@SD显著降低STING阳性衰老肺泡上皮细胞比例，FAP@BD显著降低BRD4阳性活化肺成纤维细胞比例（图6P、Q），而肝、脾和肾中的靶蛋白降解较弱。上述结果表明，GAL@SD和FAP@BD具有良好的雾化稳定性，可在对应酶作用下解体并释放具有活性的PROTAC，实现纤维化肺组织内的细胞选择性靶蛋白降解，同时减少肺外器官的脱靶作用。

图6. 吸入纳米颗粒的酶响应PROTAC释放、细胞内靶蛋白降解及肺部药效学评价。（A）有或无β-Gal存在时GAL@SD中SD的释放动力学；（B）有或无FAP-α存在时FAP@BD中BD的释放动力学；（C）负载Nile Red的GAL@SD和FAP@BD纳米颗粒经酶触发解体的示意图，货物释放后荧光淬灭；（D、F）静息或TGF-β1活化的MLF中PLGA-PEG@BDNR和FAP@BDNR释放Nile Red的代表性荧光图像及定量分析，比例尺100 μm，n = 3；（E、G）正常或BLM诱导的衰老MLE-12细胞中PLGA-PEG@SDNR和GAL@SDNR释放Nile Red的代表性荧光图像及定量分析，比例尺100 μm，n = 3；（H、I）不同纳米颗粒制剂处理后BLM诱导的衰老MLE-12细胞中STING表达的Western blot分析及灰度定量；（J–M）不同纳米颗粒制剂处理后TGF-β1活化的MLF中α-SMA、collagen I和BRD4表达的Western blot分析及灰度定量；（N）雾化吸入PBS、PLGA-PEG@SD、PLGA-PEG@BD、GAL@SD或FAP@BD后的活体全身荧光成像；（O）主要器官离体荧光强度，以平均辐射效率表示；（P）不同处理后小鼠肺组织分离的STING阳性衰老肺泡上皮细胞的定量分析；（Q）不同处理后小鼠肺组织分离的BRD4阳性活化肺成纤维细胞的定量分析。

（6）GAL@SD 和 FAP@BD 在体内的抗纤维化作用

采用单次气管内滴注BLM构建雄性C57BL/6小鼠肺纤维化模型，并按照实验流程进行吸入治疗（图7A）。造模后第9–18天，每隔1 d雾化吸入GAL@SD、FAP@BD或二者联合制剂；单药组剂量均为5 mg·kg⁻¹，联合组分别给予2.5 mg·kg⁻¹ GAL@SD和FAP@BD。每2 d监测小鼠体重，以评价一般健康状态（图7E）。Micro-CT结果显示，BLM模型小鼠出现典型磨玻璃样影和肺容积缩小，而GAL@SD联合FAP@BD治疗可明显减轻肺部病变并维持肺组织结构（图7D）。肺功能检测进一步表明，联合治疗显著改善BLM诱导的呼吸功能障碍，包括呼吸频率、50%潮气量呼气流量、增强呼气间歇、吸气时间、呼气时间、吸气峰流速及呼气峰流速等指标（图7I–O）。第21天处死小鼠并采集肺组织，结果显示，联合治疗显著降低反映胶原沉积的羟脯氨酸含量和BLM诱导升高的肺湿干重比，提示肺纤维化及肺水肿减轻（图7B、C）。H&E、Masson和天狼星红染色显示，联合治疗减少肺泡间隔破坏、胶原积聚及胶原纤维沉积（图7G）；胶原容积分数由BLM模型组的43.6 ± 1.1%降至联合治疗组的12.0 ± 0.7%，且Ashcroft评分同步降低（图7F、H）。上述结果表明，雾化吸入GAL@SD联合FAP@BD能够减轻BLM诱导的肺组织损伤、肺水肿和胶原沉积，并改善肺结构及呼吸功能。

图7. GAL@SD和FAP@BD减轻小鼠博来霉素诱导的肺纤维化。（A）PF建模及治疗干预的实验时间线，分组为：G1，正常对照；G2，BLM；G3，BLM + GAL@SD；G4，BLM + FAP@BD；G5，BLM + GAL@SD + FAP@BD；（B）各处理组肺组织中的羟脯氨酸水平；（C）肺湿/干重比（n = 5）；（D）肺部结构的代表性micro-CT图像；（E）整个实验期间小鼠体重变化；（F）肺组织切片纤维化严重程度的Ashcroft评分（n = 5）；（G）H&E、Masson三色和Picrosirius red染色的组织病理学评估，比例尺50 μm（n = 3）；（H）染色切片中胶原容积分数的定量分析（n = 3）；（I–O）肺功能参数：（I）呼吸频率，（J）潮气量50%时的呼气流量（expiratory flow 50），（K）PenH，（L）吸气时间，（M）呼气时间，（N）峰值吸气流量，（O）峰值呼气流量。

（7）GAL@SD与FAP@BD组合的抗纤维化作用机制

机制研究显示，BLM显著增加肺组织中α-SMA和Collagen I表达，而GAL@SD联合FAP@BD治疗明显降低二者的荧光信号及蛋白表达，提示成纤维细胞活化和细胞外基质沉积受到抑制（图8A–D、H）。与BLM模型组相比，联合治疗显著降低肺组织中STING和BRD4蛋白水平，并减少p21阳性衰老细胞数量，表明其可同步调控STING相关肺泡上皮细胞衰老和BRD4相关成纤维细胞活化（图8E–G）。支气管肺泡灌洗液检测显示，联合治疗降低BLM诱导升高的总蛋白浓度以及TGF-β1、IL-6和IL-1β水平，提示肺屏障损伤和炎症反应得到缓解（图8I–L）。肺组织转录组测序结果显示，与BLM模型组相比，联合治疗组共有1058个基因上调、924个基因下调，且两组差异基因表达模式明显分离（图8M–O）。功能富集分析显示，差异基因主要涉及细胞外基质组织、细胞因子信号、细胞黏附、炎症反应及纤维化相关过程，并富集于ECM–受体相互作用、细胞因子–细胞因子受体相互作用、PI3K–Akt、黏着斑、AGE–RAGE及IL-17等信号通路（图8P、Q）。上述结果表明，雾化吸入GAL@SD联合FAP@BD具有较好的短期安全性，并可通过靶向降低STING和BRD4水平，协同抑制细胞衰老、成纤维细胞活化、炎症因子释放及细胞外基质重塑，从而改善肺纤维化微环境。

图8. GAL@SD与FAP@BD联合治疗肺纤维化的作用机制。（A、B）肺组织中α-SMA表达的代表性免疫荧光图像及定量分析，绿色为α-SMA，蓝色为DAPI，比例尺100 μm；（C、D）肺组织中collagen I表达的代表性免疫荧光图像及定量分析，红色为collagen I，蓝色为DAPI，比例尺100 μm；（E）肺组织中BRD4和STING蛋白水平的Western blot分析；（F、G）肺组织中p21阳性衰老细胞的代表性免疫荧光图像及定量分析，紫色为p21，蓝色为DAPI，比例尺100 μm；（H）肺组织中Collagen I和α-SMA蛋白水平的Western blot分析；（I）支气管肺泡灌洗液中的总蛋白浓度；（J–L）ELISA测定支气管肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-6和IL-1β的浓度；（M）小鼠肺组织转录组分析示意图；（N）火山图展示博来霉素模型组与GAL@SD联合FAP@BD治疗组之间的差异表达基因；（O）热图展示对照组与GAL@SD联合FAP@BD治疗组之间差异表达基因的表达模式；（P、Q）博来霉素模型组与GAL@SD联合FAP@BD治疗组之间差异表达基因的功能富集分析。