针对上述问题，德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心Johannes Keller教授团队结合实验与临床数据，系统探索了NETs在骨折愈合及骨不连中的作用。研究发现，骨骼损伤在骨折血肿中引发快速而短暂的NETs形成，这在愈合早期有利于骨痂矿化；但持续升高的NETs会通过激活cGas-Sting信号通路，破坏偶联骨生成与血管生成的H型血管形成，进而导致骨再生受损和骨折不连。相应地，骨不连患者的血清NET标志物升高，且骨痂中NETs和STING异常蓄积。在机制明确的基础上，研究团队证实：药理学抑制NETs生成（Pad4抑制剂GSK484）或促进NETs清除（重组DNase1，即dornase alfa）可加速骨修复并预防骨不连。该文章于2026年9月2日以《Sustained neutrophil extracellular traps cause fracture nonunion》为题发表于《Science Translational Medicine》（DOI: 10.1126/scitranslmed.adx9869）。

（1）骨骼损伤在小鼠和人类的骨折血肿中触发早期NET形成

采用股骨截骨联合外固定架固定的标准化小鼠骨折模型评估NETs在骨愈合中的作用（图1A）。截骨术后2天，骨折血肿中成熟中性粒细胞（CD11b⁺Ly6G^high Ly6C^int）占比显著高于健侧骨髓（P=0.0001）（图1B）。NETs生成酶Pad4在损伤早期骨痂中强烈诱导后随愈合下降，而Dnase1和Dnase1l3表达各时间点均无变化（P>0.278）（图1C）；NETs相关基因表达各异：Bpi升高，Mpo、Elane和Ltf下降（图1D）。血清Mpo、Elane和cfDNA于术后3天短暂升高（P<0.037），第21天回落至基线（P>0.493）（图1E）。组织学显示术后2天骨折间隙及针孔周围存在白细胞浸润（图1F），该部位Mpo、H3cit和cfDNA免疫荧光信号强烈且高度共定位，提示早期骨折血肿存在活跃NETosis（图1G）。系统性应用Hmgb1中和抗体或抑制剂甘草酸均显著降低术后第2天骨折间隙NET信号（图1H），表明DAMPs触发损伤后NETosis。20例截骨矫形患者骨样本分析显示（图1I）：H&E染色下伴溶解边界和网状脱颗粒的白细胞仅见于锯切口附近（A区）（图1J），免疫荧光共定位证实NETs仅存在于A区（图1K）。因样本于截骨术中即刻固定，证明NETs在骨骼损伤后数分钟内即于骨折部位形成。

图1. 骨折损伤在小鼠和人类中触发NETs。（A）标准化截骨联合外固定架固定的骨折模型示意图。（B）术后第2天小鼠骨痂及健侧骨髓CD45⁺细胞UMAP图及成熟中性粒细胞占比定量。（C）术后不同时间点骨痂中NETs生成酶Pad4及清除酶DNase1、Dnase1l3的qRT-PCR表达。（D）同一样本中NETs组分Mpo、Elane、Bpi和Ltf的表达。（E）术后不同时间点血清NET标志物ELISA检测。（F）术后2天股骨H&E染色（上）及Mpo、H3cit和DAPI免疫荧光共染全切片（下）；虚线示皮质骨，包括骨折端（白色）和针孔（灰色）。（G）术后2天骨痂感兴趣区及高倍镜下NETs免疫荧光共染：I，不同NETosis阶段的中性粒细胞；II，排出的NET网状结构。（H）同型对照或Hmgb1中和抗体、溶媒或抑制剂甘草酸处理小鼠术后2天骨痂NETs免疫荧光共染及三标志物共定位定量。（I）闭合截骨患者骨楔采集示意图及分区：NETs富集区（A区）与无NETs区（B区）。（J）骨楔轴位H&E切片，示锯切缘白细胞浸润和网状脱颗粒。（K）骨楔A、B两区MPO、H3CIT和DAPI共染。

（2）NETs的基因调控改变骨折愈合结局

采用DNase1/Dnase1l3双敲除（D1/D1l3−/−，NETs清除受损）及在此基础上联合敲除Pad4（Pad4/D1/D1l3−/−，NETs形成受抑）的小鼠，探索NETs变化对骨折愈合的影响。免疫荧光证实术后2天D1/D1l3−/−小鼠骨痂NETs浓度高，而Pad4/D1/D1l3−/−小鼠几乎无NETs。术后7天，D1/D1l3−/−小鼠矿化骨痂较WT及Pad4/D1/D1l3−/−小鼠中度增加（图2A-D），但至第14天骨再生恢复正常，而Pad4/D1/D1l3−/−小鼠骨再生加速。术后第21天μCT显示，Pad4/D1/D1l3−/−小鼠骨痂BV（P=0.0038）和TV（P=0.0242）增加（图2E、F）；组织学显示D1/D1l3−/−小鼠骨痂矿化严重受损，该表型在Pad4/D1/D1l3−/−小鼠中逆转（图2G、H）。骨痂组织形态计量显示D1/D1l3−/−小鼠成骨细胞（P<0.008）和破骨细胞参数（P<0.009）降低，符合萎缩性骨折不连表现，Pad4/D1/D1l3−/−小鼠明显缓解（图2I、J）；半定量评分示D1/D1l3−/−小鼠骨折桥接受损，Pad4/D1/D1l3−/−小鼠完全恢复（图2K）。术后第28天生物力学显示D1/D1l3−/−小鼠骨折稳定性降低（P<0.045），Pad4/D1/D1l3−/−小鼠与WT相当（图2L）。综上，NET活性虽促进早期骨痂矿化，但最终阻碍后续愈合级联反应。

图2. NETs控制骨折愈合结局。（A）术后7天各组代表性μCT图像及（B）骨痂BV、TV定量。（C）同批小鼠骨痂Movat五色染色（黄色：矿化骨；绿色：软骨；红色：骨髓）及（D）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（E）术后21天各组μCT图像及（F）BV、TV定量。（G）同批小鼠骨痂切片及（H）矿化面积、软骨面积定量。（I）成骨细胞数量（ObN/BPm）和表面（ObS/BS）定量。（J）破骨细胞数量（OcN/BPm）和表面（OcS/BS）定量。（K）骨性骨痂桥接半定量评估：完全桥接、部分桥接、不完全桥接、不连。（L）术后28天D1/D1l3−/−和Pad4/D1/D1l3−/−小鼠股骨生物力学测试：Fbreak，骨折完全断裂所需力；work to max. force，塑性变形过程中吸收的能量。

（3）NETs在早期骨折血肿细胞中诱导成骨和cGas-Sting相关反应

从基因修饰小鼠新鲜分离的骨髓细胞（BMCs）可作为模拟早期骨折血肿的体外模型，其中中性粒细胞因分离机械应力发生自发性NETosis。RNA测序显示，成骨培养基中培养2天的D1/D1l3−/− BMCs基因表达谱显著改变（图3A），差异表达基因富集于骨矿化、免疫反应和核因子κB信号通路（图3B）；基因集富集分析显示I型和II型干扰素反应及干扰素介导的信号通路激活（图3C），与NETs作为cGas-Sting激活剂的功能一致，提示NETs在早期骨折血肿细胞中具有涉及成骨和cGas-Sting的双重作用。成骨分化实验显示D1/D1l3−/− BMCs细胞外基质矿化（P=0.002）和成骨标志物表达（P<0.033）增加，Pad4/D1/D1l3−/−培养物降至WT以下（图3D、E）；矿化不受重组Mpo或Elane抑制剂GW311616影响，但被dornase alfa诱导的cfDNA降解强烈抑制（P=0.0001）（图3F），符合cfDNA作为钙化巢核的功能，解释了D1/D1l3−/−小鼠早期矿化的暂时性增加。BMCs或PMA刺激中性粒细胞与原代巨噬细胞共培养产生典型cGas-Sting相关I型干扰素反应（图3G、H），且在两种模型中均高度依赖NETs相关Elane（图3I、J）。免疫荧光显示小鼠骨折切片Sting蛋白仅蓄积于NETs存在区域（骨折间隙、针孔、穿通血管）（图3K），人截骨样本STING蓄积亦仅见于活跃NETosis区域（图3L）。

图3. NETs在早期骨折血肿细胞中诱导成骨和cGas-Sting相关反应。（A）WT与D1/D1l3−/−组DEGs层次聚类热图（接种后24小时分离的BMCs；每组n=5）。（B）D1/D1l3−/−组上调DEGs富集的GO生物学过程。（C）GSEA示D1/D1l3−/−组上调通路。（D）成骨分化第10天各组成骨细胞茜素红染色及矿化定量。（E）分化第6天成骨标志基因（Sp7、Col1a1、Bglap）表达。（F）全程10天加/不加dornase alfa（重组DNase1）处理的茜素红染色及矿化定量。（G和H）共培养示意图：新鲜分离BMCs（G）或中性粒细胞（H）接种于原代巨噬细胞（骨髓来源，第7天），加/不加PMA处理6小时；右侧为qRT-PCR基因表达分析（Ifna1、Ifnb1、Il6）。（I和J）相同体系额外加入Elane抑制剂GW311616处理6小时。（K）术后2天小鼠股骨Sting免疫荧光图像：I，骨折间隙；II，针置入钻孔；III，穿通血管。（L）人骨楔A区（NETs富集）和B区（无NETs）STING免疫荧光图像。

（4）NETs通过cGas-Sting介导的骨痂新生血管崩溃损害骨折愈合

利用流式细胞术评估截骨术后2天早期骨折血肿和血液中的免疫细胞群体，WT、D1/D1l3−/−和Pad4/D1/D1l3−/−小鼠间中性粒细胞、B细胞、T细胞和单核细胞均无差异（图4A、B），提示D1/D1l3和Pad4/D1/D1l3缺失仅调控骨痂NETs浓度，不影响成熟中性粒细胞募集。术后第3天，与Pad4/D1/D1l3−/−小鼠相比，D1/D1l3−/−小鼠骨痂cGas-Sting靶基因（Il6、Il17a、Nfkb1、Ifnb1、Irf3）表达显著上调（P<0.05）（图4C）。鉴于激活的cGas-Sting可破坏血管生成，进一步评估愈合骨痂的新生血管：术后第14天D1/D1l3−/−小鼠偶联骨形成的H型血管密度降低（P=0.0017），额外敲除Pad4则完全恢复其形成（图4D）。截骨术后前7天给予D1/D1l3−/−小鼠cGas-Sting拮抗剂H151，μCT显示骨痂BV（P=0.0001）和TV（P=0.0001）改善（图4E、F）；未脱钙组织学显示矿化骨痂面积增加、成骨细胞参数增强（P=0.0001）、骨折桥接改善，而Pad4/D1/D1l3−/−小鼠对H151无反应（图4G-I及fig. S7，A和B）。cGas-Sting抑制恢复D1/D1l3−/−小鼠H型血管密度，对Pad4/D1/D1l3−/−小鼠无影响（图4J）。综上，NETs引起cGas-Sting依赖性的骨痂新生血管破坏，最终损害骨愈合。

图4. NETs通过cGas-Sting信号损害骨痂H型血管形成并破坏骨愈合。（A）术后2天WT和突变小鼠骨痂中性粒细胞（预门控于CD45⁺CD3⁻CD19⁻）代表性流式细胞术图及（B）所示免疫细胞群体定量。（C）术后3天和7天D1/D1l3−/−与Pad4/D1/D1l3−/−小鼠骨痂Sting靶基因表达比较（qRT-PCR）。（D）术后14天所示基因型小鼠骨折骨痂CD31和endomucin免疫组化图像及H型血管密度定量。（E）术后7天和21天所示基因型小鼠接受H151或溶媒处理的代表性μCT图像及（F）骨痂BV、TV定量。（G）同批小鼠骨痂Movat五色染色切片及（H）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（I）同批小鼠骨性骨痂桥接半定量评估。（J）术后14天各组小鼠骨折骨痂CD31和endomucin免疫组化及H型血管密度定量。

（5）持续存在的NETs驱动cGas-Sting介导的萎缩性骨不连

为检验NETs与骨不连的因果关系，采用改良截骨模型（骨折端骨膜额外电凝烧灼），术后4周WT小鼠骨不连率达100%（图5A）。经受不连手术的WT小鼠术后4周血清NET标志物Mpo、Elane和cfDNA持续升高，超过正常愈合最高水平（P<0.003）（图5B），与不连骨痂中NETs持续存在相关，而正常愈合骨痂NETs几乎消失（图5C）。术后4周，经受不连手术的Pad4/D1/D1l3−/−小鼠较WT和D1/D1l3−/−小鼠骨痂BV（P=0.0012）和TV（P=0.0019）显著增加（图5D、E），组织学表现为骨痂矿化改善、成骨细胞指数升高、骨折桥接恢复（图5F-J）。与D1/D1l3−/−小鼠相比，Pad4/D1/D1l3−/−小鼠不连骨痂cGas-Sting相关基因Il6、Il17a、Nfkb1、Ifnb1和Irf3表达于术后第14天显著降低（P<0.001）（图6A），且骨痂H型血管优先生成，而WT和D1/D1l3−/−小鼠仅微弱发育（P=0.0001）（图6B）。术后前7天给予D1/D1l3−/−小鼠H151，其BV改善程度与未处理Pad4/D1/D1l3−/−小鼠相当（图6C、D）；组织学显示矿化骨痂面积和成骨细胞参数增加（P<0.02）（图6E-H），骨折桥接改善，H型血管密度升高（P=0.0320）（图6I、J）。综上，持续存在的NETs通过cGas-Sting信号驱动萎缩性骨不连。

图5. NETs驱动骨折不连。（A）不连模型：标准化截骨间隙、外固定架固定及标准化骨膜烧灼。（B）经受不连手术的WT小鼠术后28天血清NET标志物（ELISA）；水平线示正常愈合WT小鼠对应标志物浓度（蓝色：术后第2天；粉色：术后第21天）。（C）WT小鼠正常骨折（术后21天）与不连（截骨加烧灼术后28天）骨痂Mpo、H3cit和DAPI（DNA）免疫荧光共染：I，不连中持续存在的NET簇全图；II，骨折间隙典型NET簇高倍放大；III，弥散单个NETs区域高倍放大。（D）不连术后28天各组代表性μCT图像及（E）同批小鼠骨痂BV、TV定量。（F）同批小鼠骨痂Movat五色染色切片及（G）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（H）同批小鼠骨痂ObN/BPm、ObS/BS。（I）OcN/BPm和OcS/BS。（J）骨性骨痂桥接半定量评估。

图6. 持续NETs通过cGas-Sting信号导致不连。（A）不连术后14天D1/D1l3−/−与Pad4/D1/D1l3−/−小鼠指示基因qRT-PCR表达比较。（B）不连术后14天所示基因型小鼠骨折骨痂CD31和endomucin免疫组化及H型血管密度定量。（C）不连术后28天D1/D1l3−/−小鼠接受术后前7天溶媒或H151处理的μCT图像及（D）同批小鼠骨痂BV、TV定量。（E）同批小鼠股骨Movat五色染色骨痂切片及（F）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（G）ObN/BPm、ObS/BS。（H）OcN/BPm、OcS/BS。（I）同批小鼠骨性骨痂桥接半定量评估。（J）截骨术后14天各组小鼠骨折骨痂CD31和endomucin免疫组化及H型血管密度定量。

（6）骨折不连患者NETs升高

为验证上述发现在人类中的相关性，纳入两个患者队列：骨不连队列（n=44，确诊不连，初次治疗后平均11.7个月接受翻修手术，单观察点：翻修术前）（图7A、B）；骨折队列（n=16，长骨骨折术后平均6.2个月随访，两个观察点：Tp1术前和Tp2随访，6.9%发展为不连者排除）。骨不连队列中66%为萎缩性不连、25%为肥大性不连、9%无法分类（图7C）；两组体重指数和年龄相当，不连组男性略多、骨折组女性略多（图7D），骨骼合并症和用药在不连组更常见；白细胞和血小板无差异，骨折患者Tp1时C反应蛋白升高（P=0.0041）（图7E）。不连队列翻修手术骨痂H&E染色示典型不连特征：软骨区成分不均、编织骨少、大面积纤维组织伴强烈白细胞浸润，对照骨切片（B区）免疫细胞稀疏（图7F）；免疫荧光显示大面积组织存在大量单个NETs及弥散NET网状结构（图7G），相应区域伴随STING蛋白蓄积（图7H）；mRNA水平示cGAS-STING靶基因IL6、IL17A、NFΚB1、IFNB1和IRF3表达升高（P<0.044）。血清学显示不连患者MPO和ELANE较骨折患者术前值（Tp1）升高（P=0.0001）（图7I），且骨折队列随访时（Tp2）MPO和ELANE进一步下降。这些结果提示人类骨不连与持续NETs和cGAS-STING激活相关。

图7. 骨折不愈合患者存在过量NETs。（A）骨折不愈合队列（NU）与骨折队列（Fx）的样本采集时间线。（B）愈合与未愈合股骨干骨折的代表性X线图。（C、D）两队列的骨折结局及基线特征。（E）NU队列翻修术前、Fx队列术前及随访时的血液指标。（F）健康骨组织与不愈合组织的HE染色；不愈合组织含未成熟骨、软骨、纤维组织和浸润的免疫细胞。（G、H）人不愈合组织中的NET形态及相应区域的STING免疫荧光。（I）两队列血清NET组分水平。

（7）靶向NETs改善骨愈合并降低骨折不连率

在临床前层面探索靶向NETs能否改善骨折愈合并预防小鼠骨不连。为减少NETosis，采用系统性（腹腔注射）Pad4可逆拮抗剂GSK484处理；为促进NETs清除，采用系统性（腹腔注射）重组DNase1——dornase alfa（已获美国FDA批准，在囊性纤维化患者中局部用于分解气道cfDNA网络）。正常骨折模型中（图8A），术后前7天给予GSK484或dornase alfa，术后3周μCT显示骨痂BV和TV均增加（P<0.011）（图8B、C）；组织学显示两种处理均增加矿化骨痂面积并伴随成骨细胞参数升高（P<0.048）（图8D-G）；骨痂桥接半定量评估示骨折愈合巩固改善（图8H）。在不连模型中应用相同方案（图8I），术后7天处理使术后4周骨痂BV和TV增加（P<0.012）（图8J、K）；未脱钙冷冻切片组织学证实处理小鼠矿化面积增加、成骨细胞指数改善（P<0.022）（图8L-O）。GSK484和dornase alfa处理均与该模型骨折愈合改善相关（图8P），证明靶向NETs预防不连的临床前疗效。

图8. 药理学调控NETs可有效改善骨折愈合并降低不连率。（A）正常骨折模型治疗方案；0d为0天；ip为腹腔注射。（B）术后前7天接受溶媒、GSK484或dornase alfa处理的WT小鼠骨折愈合第21天代表性μCT图像及（C）骨痂BV、TV定量。（D）同批小鼠股骨骨痂切片Movat五色染色及（E）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（F）ObN/BPm、ObS/BS。（G）OcN/BPm、OcS/BS。（H）同批小鼠骨性骨痂桥接半定量评估。（I）不连模型治疗方案。（J）术后前7天接受溶媒、GSK484或dornase alfa处理的WT小鼠骨折愈合第28天代表性μCT图像及（K）骨痂BV、TV定量。（L）同批小鼠股骨骨痂切片Movat五色染色及（M）矿化面积、软骨面积占总面积的定量。（N）ObN/BPm和ObS/BS定量。（O）OcN/BPm和OcS/BS定量。（P）同批小鼠骨性骨痂桥接半定量评估。