研究背景：

研究采用自下而上的表面引发原位聚合策略，以胺基功能化的ZnO纳米颗粒为大引发剂，引发脯氨酸-N-羧酸酐（Pro-NCA）开环聚合，制备核壳型ZnO-PLP纳米颗粒（图2a）。该修饰显著改善了水分散性：ZnO-PLP纳米颗粒悬浮液（1.0 mg/mL，以ZnO计）静置2小时以上无明显聚集或沉降，而原始ZnO纳米颗粒在相同条件下完全沉降（图2b）；动态光散射（DLS）证实ZnO-PLP在2小时后粒径分布更窄、更均一（图2c）。透射电镜（TEM）显示ZnO-PLP呈分散的纳米花状形貌（图2d），能量色散X射线（EDX）元素映射证实锌主要定位于核区（图2e）。高分辨TEM显示核区晶格条纹间距0.28 nm，对应结晶ZnO的（100）晶面（图2f）。X射线光电子能谱（XPS）检测到PLP壳层引入的氮元素（图2g）；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示酰胺I带（1622 cm⁻¹）和酰胺II带（1430 cm⁻¹）特征峰（图2h）；热重分析（TGA）确定ZnO与PLP的质量比约为73:27（图2i）。功能化纳米颗粒对革兰阳性金黄色葡萄球菌（S. aureus）、革兰阴性大肠杆菌（E. coli）和牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）均保持强效广谱抗菌活性，在100 μg/mL下实现完全根除，与未修饰的ZnO纳米颗粒相当（图2j–l）。关键的是，ZnO-PLP纳米颗粒表现出显著增强的生物相容性，在0.31–100 μg/mL所有测试浓度下溶血率均低于5%（图2m）。基于抗菌效力与生物相容性的最优组合，后续实验选用相当于100 μg/mL ZnO的剂量。

（2）PepGel@ZnO-PLP水凝胶的制备与理化性质分析

可注射PepGel水凝胶被设计为响应性基质。PepGel成胶剂为嵌段多肽pGlu-b-p(EG2K)-b-pGlu（分子量45.6 kDa），通过二乙烯乙二醇化赖氨酸NCA（EG2K-NCA）和谷氨酸NCA（Glu-NCA）的顺序一锅法开环聚合合成（图2a）。¹H核磁共振波谱、固体FT-IR和圆二色谱（CD）共同证实了嵌段共聚多肽的成功合成（图2b–d）：FT-IR在1650 cm⁻¹和1622 cm⁻¹处分别显示pGlu的α-螺旋结构和p(EG2K）嵌段的β-折叠结构特征峰。将ZnO-PLP纳米颗粒均匀分散于pGlu-b-p(EG2K)-b-pGlu共聚多肽水溶液中制备杂化PepGel@ZnO-PLP水凝胶，凝胶化在15–20 min内发生（图2e）。扫描电镜（SEM）显示其具有高度多孔的三维网络（图2f），EDX映射证实锌在整个水凝胶基质中均匀分布（图2g）。XPS分析显示PepGel@ZnO-PLP中Zn(II) 2p₃/₂结合能相较ZnO-PLP纳米颗粒或PepGel发生位移，提示水凝胶内Zn²⁺与羧酸盐基团（-COO⁻）之间存在配位作用（图2h）。该复合水凝胶兼具临床转化所需的关键特性：安全的组织粘附性（图2i）、自愈合能力，以及可在温和作用力（约6.32 N）下经细规格（0.6 mm）针头轻松注射（图2j, k）。利用感染牙周袋的弱酸性微环境，水凝胶呈现pH响应性可逆（去）溶胀行为：在pH 5.5下快速去溶胀并伴随肉眼可见的白化（图2l），这归因于-COO⁻质子化、静电斥力降低及-COOH二聚化；酸触发的去溶胀与ICP-MS定量证实的pH 5.5下Zn²⁺加速释放完全同步（图2m），确认了所设计的智能释放特性。此外，PLP的聚脯氨酸II型螺旋结构在纳米颗粒表面有序暴露仲胺基团（-NH-），使ZnO-PLP纳米颗粒在生理pH下带正电（+15.2 mV），而原始ZnO带负电（−8.6 mV）。

（3）PepGel@ZnO-PLP水凝胶的抗菌能力

采用平板涂布法评估PepGel@ZnO-PLP对三种关键口腔病原体的抗菌效力：革兰阳性变异链球菌（S. mutans）、革兰阴性牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）和具核梭杆菌（F. nucleatum）。如图3a所示，PepGel@ZnO-PLP几乎完全清除S. mutans和P. gingivalis，并在所有测试组中对F. nucleatum表现出最强的抗菌活性。与PepGel@ZnO相比，PepGel@ZnO-PLP对S. mutans和F. nucleatum的抗菌效力显著增强，而对P. gingivalis的活性相当。直接共培养后的浊度试验进一步证实了其有效抑制细菌生长的能力（图3b）。对S. mutans和P. gingivalis的SEM成像显示，PepGel@ZnO-PLP处理后细菌形态严重受损，包括细胞膜破裂和胞质内容物泄漏，细菌数量急剧减少（图3c）。TEM观察揭示了其抗菌机制：水凝胶首先直接接触并粘附于细菌表面，随后负载的ZnO-PLP纳米颗粒被细胞内化，最终导致细菌崩解（图3d）。

（4）PepGel@ZnO-PLP水凝胶在炎症条件下的体外细胞保护、ROS清除及免疫调节能力

在P. gingivalis脂多糖（LPS）刺激下，PepGel@ZnO-PLP组的RAW 264.7巨噬细胞呈现 elongated形态，提示抗炎性M2极化（图4a）。CCK-8细胞活力检测显示，无论是否经LPS刺激，PepGel@ZnO-PLP组细胞活力均显著优于对照组（图4b）；流式细胞术分析胞内ROS水平（DCFH-DA染色）显示，LPS组ROS阳性率高达94.97%，而PepGel@ZnO-PLP处理组降至29.23%（图4c）。该配方诱发了强效的M2极化巨噬细胞群体，CD206免疫荧光定量显示其相对荧光强度显著高于对照组（图4d）。转录水平上，qRT-PCR进一步验证了这些发现：M2相关标志物（Arg1、Tgfβ1）显著上调，而促炎M1标志物（Nos2）显著下调（图4e）。上述结果共同证明，PepGel@ZnO-PLP兼具缓解氧化应激与营造促愈合免疫微环境的双重能力。

（6）PepGel@ZnO-PLP水凝胶在小鼠牙周炎模型中的体内治疗效果与安全性

为评估体内疗效与安全性，研究者采用P. gingivalis感染联合丝线结扎诱导的经典小鼠牙周炎模型。建模后3天开始水凝胶治疗，共给药2次（间隔3天），末次治疗后第6天进行分析（图6a）。micro-CT二维矢状面和三维重建显示：牙周炎组出现严重的牙根暴露及颊侧、腭侧牙槽骨大面积破坏；而PepGel@ZnO-PLP水凝胶治疗显著减轻了这些病理改变，牙根暴露和牙槽骨丢失明显少于牙周炎组、PepGel组和PepGel@ZnO组（图6b）。通过测量第一、二磨牙间釉牙骨质界（CEJ）至牙槽嵴顶（ABC）的线性距离定量骨丢失：与未治疗牙周炎组相比，PepGel@ZnO-PLP组CEJ-ABC距离显著缩短约50%（图6c）；颊侧骨吸收面积减少约60%，腭侧减少约80%（图6d, e），修复效果显著优于两种对照材料。安全性方面，心、肝、脾、肺、肾的H&E染色未见任何毒性或病理损伤迹象；血液学分析显示牙周炎诱导的中性粒细胞升高/淋巴细胞降低的炎症性改变在所有水凝胶治疗组均被有效逆转，恢复至与健康小鼠无异的水平；AST、CK、CREA-S、UREA等生化指标与正常对照无显著差异，ALT水平甚至略低，表明无肝脏应激。

（7）PepGel@ZnO-PLP水凝胶的体内成骨、抗炎与免疫调节效应

H&E和Masson三色染色组织学评估显示：正常组牙槽骨结构完整；牙周炎组牙槽骨严重丢失、胶原基质破坏并伴有致密炎症浸润；而PepGel@ZnO-PLP治疗显著减轻了上述病理改变，炎症细胞明显减少、胶原纤维排列恢复有序、牙槽骨高度和宽度显著增加（图7a）。多重免疫组化和免疫荧光分析进一步阐明其治疗机制（图7b, c）：与牙周炎组相比，PepGel@ZnO-PLP治疗使成骨标志物OCN表达增加约2倍，破骨标志物TRAP和促炎细胞因子TNF-α表达均降低近50%；F4/80⁺巨噬细胞中CD206⁺细胞比例约为牙周炎组的4倍，证实治疗组M2极化增强。

（8）PepGel@ZnO-PLP水凝胶调控巨噬细胞免疫-代谢重编程的转录组学机制

为阐明其免疫调节活性的机制，研究者对经PepGel或PepGel@ZnO-PLP处理的P. gingivalis LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞进行了RNA测序。生物学重复间的高度相关性（R² > 0.98）证实了数据的稳健性（图8a）。比较分析鉴定出PepGel@ZnO-PLP组与PepGel对照相比共1090个差异表达基因（687个上调、403个下调）（图8b）。基因本体（GO）富集分析显示生物调控、刺激响应、免疫系统过程及代谢通路正调控显著富集，提示向活跃免疫代谢状态的转变（图8c）。KEGG通路分析揭示了重编程的具体驱动因素（图8d–g）：PepGel@ZnO-PLP组表现出PI3K-Akt信号通路的特异性激活（图8d），伴随M2相关修复基因（如Mrc1、VEGFa、Irf4）的上调（图8f）；关键的是，HIF-1α信号通路显著富集（图8e），伴随关键糖酵解酶（如Agrn、Mif、Spag4、Ldha）的抑制（图8g）及氧化磷酸化组分（如Atp6v1g2、Atp6v0d2、Cox6a2）的上调，呈现出糖酵解受抑、并与氧化磷酸化调节相协调的代谢状态，为维持M2效应功能建立稳态微环境。氧化应激上游调控分析进一步揭示HIF-1和p53信号通路的协同激活，它们是控制代谢重编程和细胞命运的核心枢纽。据此提出机制模型（图8h）：PepGel@ZnO-PLP持续释放锌离子并激活PI3K-Akt轴，进而调控HIF-1α等关键代谢调节因子，驱动糖酵解受抑的代谢状态，为稳定的M2修复表型建立稳态微环境。

（9）PepGel@ZnO-PLP水凝胶对炎症巨噬细胞的免疫代谢重编程验证

在P. gingivalis LPS刺激的炎症条件下，通过Seahorse分析检测糖酵解的三项细胞外酸化率（ECAR）参数（图9a）：PepGel@ZnO-PLP显著降低糖酵解速率；对糖酵解储备而言，仅PepGel@ZnO-PLP较其他各组显著降低，提示其有效耗竭了代偿性糖酵解储备；对最大糖酵解容量，PepGel@ZnO显著降低而PepGel@ZnO-PLP进一步降至显著低于PepGel的水平，表明ZnO纳米颗粒负载可部分抑制该容量，而PLP进一步增强此效应。同时，LPS刺激下PepGel@ZnO-PLP组胞内乳酸显著减少、葡萄糖含量增加（图9b）；氧消耗率（OCR）测量显示其较LPS组氧消耗更高，且最大呼吸量和储备呼吸能力均显著增强（图9c），提示代谢谱向氧化磷酸化方向转变。这些结果共同证明，PepGel@ZnO-PLP通过PLP介导的界面工程抑制炎症巨噬细胞糖酵解并重编程代谢稳态。