（1）单细胞转录组分析揭示ROS和铁死亡参与骨质疏松发病机制

通过整合分析骨质疏松患者单细胞RNA测序数据，经严格质控和Harmony算法校正批次效应后，共获得23,883个细胞样本，鉴定出12种具有独特表达模式的细胞类型。分析发现，骨质疏松组股骨头组织中免疫细胞和脂肪细胞比例增加，而成骨细胞比例减少，呈现脂肪生成偏倚和慢性炎症表型。进一步分析显示，成骨细胞表现出显著的ROS应激特征，且铁死亡相关促因子在成骨细胞中显著富集。骨质疏松组的ROS相关评分和铁死亡驱动因子评分显著高于对照组，而铁死亡抑制因子显著下调。这些结果在单细胞水平证实ROS和铁死亡是骨质疏松发展的关键驱动因素，为后续设计兼具抗氧化保护与铁死亡抑制功能的智能生物材料提供了理论基础。

图1. 单细胞转录组分析揭示ROS和铁死亡在骨质疏松发病机制中的作用。a) 4例骨质疏松和1例非骨质疏松人股骨头样本共23,883个细胞经UMAP降维可视化得到12个细胞亚群。b) 各细胞亚群标志基因表达的小提琴图。c) 各样本细胞类型比例的堆叠柱状图。d) 不同细胞亚群中ROS相关通路和铁死亡相关通路基因集的密度分布UMAP图。e) 骨质疏松与非骨质疏松样本中ROS相关及铁死亡相关通路的bubble图比较。f) 两组间ROS相关评分、铁死亡驱动因子和抑制因子评分的box图比较。

（2）QCDs、ZIF-8、Z-QCDs及M2-Migs的制备与表征

采用水热法合成QCDs，TEM显示其呈球形，平均粒径2.15±0.43 nm，HRTEM显示晶格间距0.22 nm，具有类石墨烯结构。通过配位自组装将QCDs封装于ZIF-8中制备Z-QCDs，Z-QCDs保持了ZIF-8典型的十二面体结构，平均粒径增至152 nm。FTIR、XRD、XPS和Zeta电位结果进一步证实了Z-QCDs的成功合成，QCDs在ZIF-8内分散良好、未发生明显聚集。从M2巨噬细胞中成功分离纯化M2-Migs，TEM显示其呈圆形并含有空泡，平均粒径855.1 nm，携带负电荷；WB证实其高表达迁移体标志物NDST1和TSPAN4，弱表达传统外囊泡标志物TSG101，排除了细胞碎片和微囊泡污染。

图2. QCDs、ZIF-8、Z-QCDs及M2-Migs的制备与表征。a) QCDs、ZIF-8和Z-QCDs的合成流程示意图。b、c) QCDs的TEM图像和粒径分布（平均2.15±0.43 nm）。d) QCDs的HRTEM图像，晶格间距0.22 nm。e) ZIF-8的外观、TEM、SEM、EDS元素分布图和EDS能谱。f) Z-QCDs的外观、TEM、SEM、EDS元素分布图和EDS能谱。g) QCDs附着于ZIF-8的TEM图像。h) ZIF-8和Z-QCDs的粒径分布。i-l) QCDs、ZIF-8和Z-QCDs的FTIR、XRD、XPS光谱和Zeta电位（n=3）。m) M2-Migs的TEM图像。n、o) M2-Migs的粒径分布和Zeta电位。p) 细胞体和M2-Migs中NDST1、GAPDH、TSG101和TSPAN4的WB分析。

（3）纳米复合水凝胶的理化性质表征

OHA与PP通过动态硼酸酯键和席夫碱键交联，在3秒内快速成胶。Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶表现出优异的可注射性和剪切变稀特性，可通过注射器轻松挤出并完美填充不规则骨缺损。流变学测试显示，在频率扫描和时间扫描中G'始终大于G''，表明成功形成稳定的凝胶网络。SEM显示水凝胶具有高度互联的多孔微观结构，Z-QCDs纳米颗粒清晰可见于孔壁。压缩实验表明Z-QCDs和M2-Migs的引入增强了水凝胶的机械强度。溶胀实验显示水凝胶在6小时内快速吸水，10小时达到平衡，Z-QCDs和M2-Migs的加入降低了平衡吸水率，从而增强了机械稳定性和结构完整性。

图3. 纳米复合水凝胶的表征。a) OHA溶液与Z-QCDs@M2-Migs@PP溶液混合形成Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶的照片。b) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶通过注射器挤出形成“SCI”字样的可注射性展示。c-e) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶的频率扫描、时间扫描和剪切变稀流变学测试。f) OHA-PP、Z-QCDs@OHA-PP和Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶的SEM图像（比例尺，100 μm和50 μm）。g) 各组水凝胶压缩测试的应力-应变曲线。h) 各组水凝胶在PBS中的溶胀性能。

（4）纳米复合水凝胶的pH/ROS双响应性、降解及自由基清除能力

在低pH或高ROS刺激下，水凝胶动态硼酸酯键和席夫碱键断裂，网络结构解体，由凝胶态转变为溶胶态，G'显著下降；尤其在pH+ROS联合刺激下孔隙率降至17.98%，网络结构明显坍塌。体外降解实验显示，在模拟骨质疏松微环境（pH 5.0+1 mM H₂O₂）中，水凝胶逐渐降解，Z-QCDs和M2-Migs响应性释放，第14天M2-Migs释放率达92.31%。自由基清除实验表明，Z-QCDs对DPPH•、ABTS•和HO•具有显著浓度依赖性清除能力，IC50约为30 μg/mL；Z-QCDs@OHA-PP和Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶对DPPH•和HO•的清除效率分别达约70%和80%，表现出优异的广谱抗氧化性能。

图4. 纳米复合水凝胶的pH/ROS双响应性、降解、材料释放性能及体外自由基清除能力。a-d) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶经PBS、H₂O₂、pH=5和H₂O₂+pH处理后的外观图像、频率扫描流变曲线、SEM图像（比例尺，100 μm）和孔隙率定量（n=6）。e、f) OHA-PP水凝胶和Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶在不同条件下的体外降解剩余重量（%）（n=5）。g、h) pH 5.0和pH 5.0+1 mM H₂O₂条件下QCDs的体外累积释放曲线（n=5）。i) pH 7.4和pH 5.0+1 mM H₂O₂条件下M2-Migs从水凝胶中的体外累积释放曲线（n=5）。j-m) 纳米复合水凝胶对DPPH•、ABTS•和HO•自由基清除能力的UV-vis光谱检测。n-q) 纳米复合水凝胶处理后DPPH•、ABTS•和HO•自由基溶液的颜色变化照片。r-u) 纳米复合水凝胶对DPPH•、ABTS•和HO•自由基清除率的定量分析（n=5）。

（5）纳米复合水凝胶的免疫调节特性

在H₂O₂诱导的炎症微环境中，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP显著降低巨噬细胞M1型标志物（IL-6、iNOS、TNF-α）的mRNA表达，同时显著上调M2型标志物（Arg-1、CD206、TGF-β）的表达。ELISA结果进一步证实TNF-α和IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高。免疫荧光染色显示，该水凝胶显著抑制iNOS表达并增强CD206表达，表明其能有效促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型极化。值得注意的是，M2-Migs的引入对Z-QCDs的抗炎活性未产生协同增强，但在促进M2极化方面表现出协同效应，这对后续骨再生过程的启动至关重要。

图5. 纳米复合水凝胶的免疫调节特性。a) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP纳米复合水凝胶重编程巨噬细胞功能的示意图。b-d) H₂O₂刺激后第1天巨噬细胞M1相关基因（IL-6、iNOS、TNF-α）的相对mRNA表达（n=3）。e-g) H₂O₂刺激后第1天巨噬细胞M2相关基因（Arg-1、CD206、TGF-β）的相对mRNA表达（n=3）。h、i) 第1天巨噬细胞M1相关蛋白（iNOS）和M2相关蛋白（CD206）的免疫荧光染色图像（比例尺，100 μm）。

（6）纳米复合水凝胶的细胞内ROS清除及线粒体保护作用

DCFH染色和定量分析显示，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP能最有效地降低H₂O₂诱导的细胞内ROS水平，接近正常水平。该水凝胶显著上调抗氧化基因CAT和SOD-1表达，降低脂质过氧化产物MDA含量，恢复SOD活性和GSH/GSSG比值，重建细胞内抗氧化防御体系。JC-1染色表明其能显著恢复线粒体膜电位；MitoSOX染色显示其显著减少线粒体超氧化物产生。TEM观察证实，该水凝胶能有效保护线粒体膜结构和嵴形态，减轻氧化应激导致的线粒体肿胀、嵴断裂和空泡化，通过清除ROS和阻断氧化应激级联反应维持线粒体稳态。

图6. 纳米复合水凝胶的抗氧化能力、细胞内ROS清除活性及线粒体保护能力。a) 各组MC3T3-E1细胞DCFH染色图像（比例尺，100 μm）。b) DCFH平均荧光强度的定量分析（n=3）。c、d) 纳米复合水凝胶处理后细胞内CAT和SOD-1的相对mRNA表达（n=3）。e) 线粒体膜电位的半定量荧光结果（n=3）。f) 各组线粒体膜电位JC-1荧光图像（比例尺，20 μm）。g-i) 各组细胞MDA水平、SOD活性和GSH/GSSG比值（n=3）。j) 线粒体ROS水平的MitoSOX半定量分析（n=3）。k) 各组MitoSOX荧光图像（比例尺，50 μm）。l) 各组线粒体超微结构TEM图像（比例尺，500 nm和200 nm）。m) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP纳米复合水凝胶清除ROS并保护线粒体的机制示意图。

（7）纳米复合水凝胶的体外促成骨分化能力

在H₂O₂模拟的氧化应激成骨条件下，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP显著促进MC3T3-E1细胞成骨分化。ALP染色和活性检测显示其ALP表达较H₂O₂组提升约2.9倍；ARS染色显示矿化结节形成增加约4.4倍。qRT-PCR结果表明，Runx-2、Col 1、ALP和OCN等成骨相关基因表达在干预后于第7天和第14天均显著恢复。免疫荧光显示Runx-2、Col 1和OCN的荧光强度分别提升约2.8、2.7和2.3倍。结果表明，Z-QCDs通过清除ROS有效恢复成骨能力至正常水平，而M2-Migs的引入进一步协同增强了成骨分化效果，验证了该材料设计的合理性。

图7. 纳米复合水凝胶的体外成骨能力评估。a) 成骨诱导第14天各组ALP染色代表性图像。b) 成骨诱导第21天各组ARS染色代表性图像。c) ALP活性定量分析（n=3）。d) 矿化结节形成定量分析（n=3）。e-h) 成骨诱导第7天各组成骨相关基因（Runx-2、Col 1、ALP、OCN）的相对mRNA表达（n=3）。i-l) 成骨诱导第14天各组成骨相关基因（Runx-2、Col 1、ALP、OCN）的相对mRNA表达（n=3）。m-o) 各组Runx-2、Col 1和OCN荧光强度的半定量分析（n=3）。p-r) 各组Runx-2、Col 1和OCN免疫荧光染色代表性图像（比例尺，50 μm）。

（8）纳米复合水凝胶对铁死亡的抑制作用

FerroOrange染色显示，H2O2刺激导致细胞内Fe²⁺大量积累，而Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP干预后Fe²⁺水平恢复至接近正常，有效缓解铁超载。免疫荧光和WB结果表明，该水凝胶显著恢复抗铁死亡蛋白GPX4表达，下调促铁死亡蛋白ACSL4和二价铁转运蛋白DMT1表达，有效逆转H₂O₂诱导的铁死亡分子表型。BODIPY染色证实其能显著减少细胞内脂质过氧化。在Erastin诱导的铁死亡条件下，该水凝胶有效恢复ALP活性和矿化结节形成。体内免疫荧光进一步证实，治疗组骨缺损区域GPX4表达显著上调，表明该水凝胶在体内外均能有效抑制氧化应激相关铁死亡，发挥细胞保护作用。

图8. 纳米复合水凝胶的体外和体内铁死亡抑制能力评估。a) 各实验组MC3T3-E1细胞FerroOrange染色代表性图像（比例尺，50 μm）。b) 各实验组GPX4免疫荧光代表性图像（比例尺，50 μm）。c) FerroOrange荧光强度半定量分析（n=3）。d) GPX4荧光强度半定量分析（n=3）。e、f) 各实验组ACSL4、DMT1和GPX4蛋白表达的WB代表性图像及相应统计分析（n=3）。g、h) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP体内治疗骨质疏松骨缺损区域后GPX4免疫荧光代表性图像及统计分析（n=5）。

（9）RNA测序揭示PI3K-AKT信号通路介导成骨分化机制

对MC3T3-E1细胞进行RNA-seq分析，共鉴定出1653个差异表达基因。GO分析显示其促进DNA修复、线粒体电子传递和氧化还原酶活性等生物学过程。KEGG和GSEA分析一致表明PI3K-AKT信号通路显著富集并上调。热图显示Akt1、Bcl2、Pik3ap1等关键基因表达上调。WB验证表明，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP显著增加p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的磷酸化水平。进一步使用PI3K-AKT通路抑制剂LY294002进行功能抑制实验，结果显示该水凝胶促进的OCN表达被削弱，证实其通过激活PI3K-AKT信号通路及其下游mTOR来促进成骨分化。

图9. RNA测序分析揭示Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP促进成骨的分子机制。a) Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP组 vs. 对照组差异表达基因（DEGs）火山图（|log2(Fold Change)|>1，P<0.05）。b、c) GO富集分析的柱状图和气泡图（BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能）。d、e) KEGG富集分析的柱状图和气泡图。f) PI3K-AKT信号通路的GSEA富集图。g) PI3K-AKT信号通路相关DEGs热图。h) PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR）表达的WB条带。i) p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平的定量分析（n=3）。

（10）纳米复合水凝胶促进骨质疏松骨缺损的体内再生

在OVX小鼠骨质疏松骨缺损模型中，Micro-CT三维重建显示Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP组新生骨填充最明显，骨小梁结构更致密连续。定量分析显示该组骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）最高，骨小梁分离度（Tb.Sp）最低，骨再生能力最强。H&E染色显示缺损区新生骨形成和成熟组织填充更多；Masson三色染色显示该组胶原和骨基质沉积更丰富连续，骨组织面积百分比显著高于其他组。体内降解实验表明水凝胶在10天内几乎完全降解，具有良好的生物相容性和适宜的降解速率，为骨组织再生提供了必要的临时结构支持。

图10. Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶修复骨质疏松骨缺损的体内疗效。a) 建立OVX小鼠骨质疏松骨缺损并植入水凝胶的流程示意图。b) 术后2周各组股骨缺损的Micro-CT三维重建及横截面图像。c) 新生骨组织BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp的定量分析（n=5）。d) 术后2周各组远端股骨H&E染色和Masson三色染色代表性图像（比例尺，200 μm）。e) Masson三色染色骨组织面积百分比的定量分析（n=5）。

（11）纳米复合水凝胶调节体内免疫微环境与成骨活性

免疫荧光显示，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP组骨缺损区域OCN和OSX阳性信号最强，定量分析表明其成骨活性和骨基质形成能力显著优于其他各组。同时，该组M2巨噬细胞标志物CD206荧光强度最高，而M1标志物CD86和iNOS表达最低。这表明该水凝胶能在体内诱导巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎修复型M2表型转化，同时抑制促炎表型，通过“免疫-成骨”耦合机制显著改善骨质疏松骨缺损再生能力。主要器官H&E染色未见异常变化，溶血率接近0%，进一步证实其优异的生物相容性和临床应用潜力。

图11. Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP水凝胶对骨质疏松骨缺损成骨相关表型和炎症微环境的体内调节作用。a) 不同处理后骨缺损区域OCN免疫荧光染色代表性图像（比例尺，100 μm）。b) OCN阳性面积率的半定量分析（n=5）。c) 不同处理后OSX免疫荧光染色代表性图像（比例尺，100 μm）。d) OSX阳性面积率的半定量分析（n=5）。e、f) 不同处理后骨缺损区域CD206荧光代表性图像及相对荧光强度统计分析（n=5）（比例尺，100 μm）。g、h) 不同处理后CD86荧光代表性图像及统计分析（n=5）（比例尺，100 μm）。i、j) 不同处理后iNOS荧光代表性图像及统计分析（n=5）（比例尺，100 μm）。