方案1. FeMnDA/BCNT纳米酶的合成及其清除ROS与抑制细胞焦亡的原理示意图。

图1. FeMnDA/BCNT纳米酶的合成与表征。(a) FeMnDA/BCNT的SEM图像，比例尺：200 nm。(b) FeMnDA/BCNT的TEM图像，比例尺：500 nm。(c) 不同放大倍数的FeMnDA/BCNT的TEM图像，比例尺：100 nm。(d-e) FeMnDA/BCNT的元素mapping，显示C、N、Fe和Mn元素，比例尺：100 nm。(f) 高角环形暗场扫描透射电镜图像，比例尺：2 nm。(g) FeMnDA/BCNT和BCNT的XRD图谱。(h) FeMnDA/BCNT和BCNT的拉曼光谱。(i-l) FeMnDA/BCNT的高分辨XPS谱：(i) C 1s，(j) N 1s，(k) Fe 2p，(l) Mn 2p。(m) 不同样品的Fe K-edge XANES谱。(n) 不同样品的k2加权χ(k)傅里叶变换EXAFS谱。(o) FeMn中Fe的平均氧化态。(p) R空间中FeMnDA/BCNT的Fe K-edge EXAFS拟合谱。(q) 不同样品的Mn K-edge XANES谱。(r) 不同样品的k2加权χ(k)傅里叶变换EXAFS谱。(s) FeMn中Mn的平均氧化态。(t) R空间中FeMnDA/BCNT的Mn K-edge EXAFS拟合谱。

（2）酶模拟活性及机理研究

基于XAS和XPS结果，对FeMnDA/BCNT的SOD和CAT催化反应进行DFT计算。PDOS显示Fe与Mn的d轨道在费米能级附近存在电子态重叠，表明存在d-d轨道耦合；差分电荷密度分析显示Mn和Fe分别净失电子1.278和1.229个，且二者3dz²轨道重叠（图2a-c）。电荷密度差图表明FeMn双原子向吸附的H₂O₂和O₂发生明显电子转移，而pristine BCNT呈弥散PDOS并对小分子弱吸附（图2d-g）。反应路径模拟显示，SOD样反应决速步能垒由BCNT的0.83 eV降至0.24 eV（图2h）；CAT样反应能垒由1.63 eV降至0.10 eV（图2i）。实验方面，FeMnDA/BCNT表现出浓度依赖的SOD样活性，BCNT活性可忽略（图2j,k）；可高效分解H₂O₂（图2l,m）；并以剂量依赖方式清除H₂O₂（图2n,o）。其SOD、CAT和GPx样活性约为BCNT的15倍，高于天然HRP，且在酸性和碱性环境中均保持活性，无OXD和POD样活性。

图2. FeMnDA/BCNT纳米酶的DFT计算及SOD、CAT和GPx模拟活性测试。(a-b) FeMnDA/BCNT纳米酶的PDOS和差分电荷密度图。(c) Fe和Mn 3dz2轨道的PDOS。(d) FeMnDA/BCNT与H2O2之间的PDOS。(e) FeMnDA/BCNT与O2之间的PDOS。(f) BCNT与H2O2之间的PDOS。(g) BCNT与O2之间的PDOS。(h-i) DFT计算得到的FeMnDA/BCNT纳米酶SOD样和CAT样催化反应过程的能量图。(j) 不同浓度下FeMnDA/BCNT纳米酶的SOD活性。(k) 1/FeMnDA/BCNT纳米酶SOD活性与1/抑制率之间的线性关系。(l) 不同浓度下FeMnDA/BCNT纳米酶的CAT活性。(m) FeMnDA/BCNT酶CAT活性的标准曲线。(n) 不同浓度下FeMnDA/BCNT纳米酶的GPx活性。(o) FeMnDA/BCNT纳米酶GPx活性的标准曲线。

（3）FeMnDA/BCNT纳米酶对细胞摄取、溶酶体逃逸和ROS清除的影响

GEO数据集（GSE57218、GSE10575、GSE16464）分析显示，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、AIM2和PYCARD等焦亡相关基因在OA组织中显著上调；富集和单细胞分析证实HomC和HTC软骨细胞亚群中焦亡信号升高，免疫组化验证OA软骨中焦亡标志物表达增加。Cy5标记的FeMnDA/BCNT共聚焦成像显示其12小时内被软骨细胞有效摄取，且对炎症软骨细胞的摄取高于未包覆组（图3a）。共定位分析显示，BCNT和FeMnDA/BCNT的皮尔逊系数为0.91–0.92；膜包覆组在正常和LPS诱导条件下的皮尔逊系数仅0.07和0.17，证实其溶酶体逃逸能力（图3b）。DCFH-DA检测显示，LPS + nigericin组（G2）及BCNT组（G3）绿色荧光较强，FeMnDA/BCNT组（G4、G5）荧光显著降低（图3c,h）；其还可清除·NO、·OH和O₂·⁻（图3d-g, i-l）。流式细胞术定量显示，G2、G3组细胞内ROS约为85%–87%，G5组降至21.4%（图3m）。上述结果表明，FeMnDA/BCNT具有高效细胞内化、溶酶体逃逸和ROS清除能力。

图3. FeMnDA/BCNT纳米酶的细胞摄取、溶酶体逃逸和ROS清除。(a) 培养12小时后软骨细胞吞噬Cy5标记的FeMnDA/BCNT纳米酶的CLSM荧光图像，比例尺：50 μm。(b) BCNT、FeMnDA/BCNT和FeMnDA/BCNT在RAW 264.7细胞和LPS激活的RAW264.7细胞中的溶酶体逃逸CLSM荧光图像。Cy5标记的BCNT、FeMnDA/BCNT和FeMnDA/BCNT：红色；FITC标记的溶酶体：绿色；DAPI染色的软骨细胞核：蓝色，比例尺：10 μm。(c-l) 不同处理后（c,h）DCFH-DA、（d,i）DAF-FM、（e,j）HPF、（f,k）DHE、（g,l）Rudpp3Cl2染色软骨细胞的共聚焦图像及细胞内荧光强度的定量分析，比例尺：170 μm。(m) 不同处理下FITC-A通道中2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）标记细胞的流式细胞术分析。

（4）FeMnDA/BCNT纳米酶恢复线粒体功能并抑制细胞焦亡

线粒体ROS可激活NLRP3炎症小体，引发caspase-1激活及IL-1β/IL-18释放，并导致线粒体膜电位丧失和功能障碍。细胞毒性实验显示，80 μg mL⁻¹ FeMnDA/BCNT处理下细胞活力约为90%。Calcein-AM/PI染色显示，G2（LPS + nigericin）和G3（BCNT + LPS + nigericin）组死细胞较多，G2组细胞活力降至59%，FeMnDA/BCNT组（G4）恢复至75%，膜包覆组（G5）达83%（图4a-d）。JC-1染色显示，G2、G3组线粒体膜电位下降，G4、G5组红/绿荧光比值恢复（图4e）；G5组LDH释放降低并防止ATP耗竭。免疫荧光显示，G2组NLRP3、Caspase-1表达强烈，G5组显著抑制，IL-1β和IL-18荧光强度亦降低（图4f-i）。qRT-PCR显示G5组对NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18基因的下调作用最强（图4j-n）；Western blot证实G5组抑制NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表达（图4o-r），并抑制NF-κB、MMP-13和IL-6表达。上述结果表明，FeMnDA/BCNT通过降低焦亡相关因子表达抑制软骨细胞焦亡。

图4. FeMnDA/BCNT纳米酶的体外细胞保护活性及抑制NLRP3炎症小体激活、减轻焦亡。(a) 不同处理后软骨细胞的Calcein-AM/PI染色，比例尺：430 μm。(b) PI和calcein共染后各组死亡和活软骨细胞的定性数据。(c) 不同处理后膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色流式细胞术分析。(d) 80 μg mL-1各材料组不同处理后软骨细胞的相对存活率。(e) JC-1检测试剂盒检测不同处理后软骨细胞线粒体膜电位变化，比例尺：170 μm。(f-i) 不同处理后软骨细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫荧光抗体染色的荧光强度共聚焦图像。(j-n) 不同处理后软骨细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的相对mRNA表达水平（qRT-PCR检测）。(o-r) LPS + nigericin诱导后Western blot测定NLRP3、Caspase-1和GSDMD的蛋白水平。

（5）FeMnDA/BCNT纳米酶治疗OA的体内疗效

体内荧光成像显示，关节腔注射Cy5.5标记的膜包覆FeMnDA/BCNT后，其在OA部位滞留长达7天，长于未包覆组，且在炎症组织中的荧光强度和滞留高于非炎症组织，主要经肾脏、肝脏和结肠代谢排泄；AKI和ALI模型中亦观察到炎症部位优先聚集。溶血实验显示200 μg mL⁻¹下无溶血活性；主要器官H&E染色未见病理异常；关节腔和静脉注射28天后血常规及肝肾功能指标与生理盐水组相当。在ACLT诱导的大鼠OA模型中（图5a），大体观察显示G2（生理盐水）组软骨严重侵蚀、关节间隙变窄，G4组软骨完整性改善，G5组接近假手术组（G1）（图5b,c）。H&E和番红O染色显示G2组软骨侵蚀、滑膜增生和蛋白多糖含量下降明显，G5组软骨损伤减轻、蛋白多糖保留，OARSI评分接近G1（图5d-f）。免疫组化和免疫荧光显示G5组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达接近G1基线（图5g-i）；滑液中HIF-1α、ROS、MMP-13、IL-6和NLRP3水平显著降低，ATP水平升高。上述结果表明FeMnDA/BCNT通过抑制NLRP3介导的焦亡延缓OA进展。

图5. 基于FeMnDA/BCNT纳米酶清除ROS的体内OA缓解实验。(a) 使用BCNT、FeMnDA/BCNT和FeMnDA/BCNT纳米酶进行体内OA缓解的流程示意图。(b) 治疗8周后各组大鼠膝关节的大体观察。(c) 治疗8周后各组大鼠膝关节的大体评分。(d-e) 治疗8周后不同组OA大鼠膝关节H&E染色（d）、番红O-固绿染色（e）的光学图像，比例尺：500 μm。(f) 治疗8周后各组大鼠膝关节OARSI评分。(g) 各组IL-1β和IL-18的CLSM图像及（h-i）荧光定量水平，比例尺：170 μm。

（6）FeMnDA/BCNT纳米酶治疗AKI的体内疗效

在甘油诱导的AKI模型中，FeMnDA/BCNT纳米酶（G5）显著改善肾损伤。大体观察显示肾脏肿大减轻、形态改善（图6a）；组织学分析显示肾小管坏死明显缓解、炎症浸润减少（图6b）。肾功能生化指标（BUN、CREA、SOD、CYCS和CCr）恢复正常至接近基线水平（图6c-g），同时IL-1β和IL-18表达显著降低（图6h-k）。与G2、G3、G4组相比，G5组还显著降低肾组织匀浆中HIF-1α、ROS、MMP-13、IL-6和NLRP3水平并升高ATP水平。这些结果突出了FeMnDA/BCNT通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体激活发挥有效的肾脏保护作用。

图6. FeMnDA/BCNT纳米酶对AKI的治疗效果。(a) 各组代表性肾脏样本。(b) 各组肾组织H&E染色图像，箭头指示管型形成，比例尺：100 μm。(c-g) 不同处理后血清肾功能指标BUN、CRE、SOD、CYCS和CCr水平。(h-i) 肾脏IL-1β和IL-18免疫组化光学图像，比例尺：200、100 μm。(j-k) 免疫组化定量。

（7）FeMnDA/BCNT纳米酶治疗ALI的体内疗效

在四氯化碳（CCl4）诱导的ALI模型中，FeMnDA/BCNT纳米酶（G5）有效减轻肝损伤和炎症反应。大体观察和H&E染色显示肝出血、坏死和炎症浸润明显减少（图7a,b）；肝功能指标（ALT、AST、ADA、TBIL）较未治疗组显著改善（图7c-f）。免疫组化分析证实IL-1β和IL-18表达降低（图7g-j）；与G2、G3、G4组相比，G5组显著降低肝组织匀浆中HIF-1α、ROS、MMP-13、IL-6和NLRP3水平并升高ATP水平，进一步强调其通过减轻NLRP3介导的炎症发挥的肝脏保护作用。

图7. FeMnDA/BCNT纳米酶对ALI的治疗效果。(a) 各组代表性肝脏样本。(b) 各组肝组织H&E染色图像，比例尺：500、100 μm。(c-f) 不同处理后血清肝功能指标ALT、AST、ADA和TBIL水平。(g-h) 肝脏IL-1β和IL-18免疫组化光学图像，比例尺：200、100 μm。(i-j) 免疫组化定量。