（1）H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man的合成与表征

通过室温下Zn²⁺和Cu²⁺与2-甲基咪唑在甲醇中共组装制备Cu/Zn-MOF。透射电子显微镜（TEM）观察显示，Cu/Zn-MOF呈菱形十二面体形貌，平均直径约100 nm。扫描透射电子显微镜-能谱（STEM-EDS）mapping证实Cu、Zn、C、N和O均匀分布。ICP-MS定量分析表明，Cu/Zn-MOF中Cu和Zn的质量百分比分别为0.55%和18.15%。随后通过溶剂蒸发法将STING拮抗剂H-151负载于Cu/Zn-MOF，载药量（DLC）和包封率（EE）分别为34.76±0.21%和63.93±0.61%。

为赋予平台被动和主动靶向能力，将RAW 264.7巨噬细胞膜与甘露糖基化脂质体融合构建杂化膜（LM@Man），共聚焦成像显示FITC和Cy5荧光信号共定位证实了膜融合。LM@Man包覆后，TEM显示清晰的膜结构，粒径从97.6 nm增至119.2 nm，Zeta电位从18.2 mV逆转为−18.5 mV。Western blot和SDS-PAGE分析证实了巨噬细胞膜标志物F4/80和CD11b的保留。XRD显示MOF晶体结构在载药和膜工程后得以保持。FT-IR和XPS进一步验证了H-151的成功负载和LM@Man的包覆。 importantly, 该纳米斗篷在酸性炎症环境（pH 5.4）中释放53%的负载药物，而在生理条件（pH 7.4）下仅释放20.3%，表现出pH响应性释药特性，且在水、PBS、DMEM和10% FBS中保持优异的胶体稳定性。

图2. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man的合成与详细表征。a) 模块化组装示意图；b) Cu/Zn-MOF的TEM图像，比例尺100 nm；c) CLSM图像显示巨噬细胞膜（红色，Cy5标记）和脂质体（绿色，FITC标记）的融合，比例尺500 nm；d) H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man的TEM图像，比例尺100 nm；e) STEM-EDS元素mapping；f) 各种膜样品中F4/80和CD11b的Western blot；g) SDS-PAGE分析；h) 不同框架的XRD图谱；i) FT-IR光谱；j) XPS全谱；k) Zeta电位和粒径测量；l) pH 5.4条件下48 h后的TEM图像，比例尺100 nm；m) pH 7.4和5.4条件下的药物释放曲线。

（2）H-151-Cu/Zn-MOF的体外自由基清除能力

为系统评估H-151-Cu/Zn-MOF的抗氧化潜力，在pH 5.4的PBS中测试了其对多种自由基的清除能力。ABTS•+清除实验显示，在80 μg mL⁻¹浓度下清除效率达98.5%；对DPPH•的清除率达66%。在炎症相关关键ROS清除方面，H-151-Cu/Zn-MOF表现出强效的•O₂⁻清除活性，80 μg mL⁻¹时效率超过90%。与Zn-MOF、Cu-MOF和Cu/Zn-MOF相比，H-151-Cu/Zn-MOF显示出最优的•OH清除能力。此外，该材料对H₂O₂和一氧化氮自由基（•NO）也表现出明显的浓度和时间依赖性清除活性。值得注意的是，H-151-Cu/Zn-MOF几乎不具有过氧化物酶（POD）和氧化酶（OXD）样催化活性，表明其表现为强抗氧化而非促氧化行为。

图3. H-151-Cu/Zn-MOF的抗氧化和ROS清除活性。a,c) ABTS•+和DPPH•的UV-vis吸收光谱；b,d) 不同浓度下对ABTS•+和DPPH•的时间依赖性清除曲线；e,g) •O₂⁻和•OH清除的UV-vis光谱；f,h) 不同浓度下对•O₂⁻和•OH的时间依赖性清除曲线；i) H₂O₂清除活性；j) H-151-Cu/Zn-MOF的ROS清除抗氧化功能示意图；k) 总结ROS清除和酶样活性的雷达图。

（3）DFT计算揭示SOD样超氧阴离子清除机制

基于体外实验结果，进一步通过密度泛函理论（DFT）计算探究SOD样反应路径。构建了Zn-MOF、Cu-MOF、Cu/Zn-MOF和H-151-Cu/Zn-MOF的优化模型。差分电荷密度分析显示H-151与Cu/Zn-MOF框架之间存在明显的电子重分布。PDOS分析表明，引入H-151改变了Cu和Zn位点的电子态分布，Cu d带中心从−1.67 eV移至−1.64 eV，并增强了Cu 3d与Zn 3d轨道在−5至0 eV范围内的能量共振。自由能计算显示，H-151-Cu/Zn-MOF的反应自由能势垒最低（0.22 eV），低于Cu/Zn-MOF（0.34 eV）、Cu-MOF（0.53 eV）和Zn-MOF（0.80 eV）。这表明H-151并非直接配位催化配体，而是通过影响Cu/Zn-MOF的电子结构，降低SOD样过程的能量势垒，从而增强抗氧化活性。

图4. DFT探究H-151-Cu/Zn-MOF的SOD样超氧阴离子清除路径。a) Zn-MOF、Cu-MOF、Cu/Zn-MOF和H-151-Cu/Zn-MOF的优化结构模型；b) H-151-Cu/Zn-MOF的差分电荷密度图，黄色表示电子积累，青色表示电子耗尽；c) Zn-MOF、Cu-MOF、Cu/Zn-MOF和H-151-Cu/Zn-MOF的PDOS数据；d) H-151-Cu/Zn-MOF的DFT计算SOD样超氧阴离子清除路径；e) 不同纳米颗粒上SOD样超氧阴离子清除过程的自由能曲线。

（4）H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man的体外ROS清除与抗炎作用

在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中评估了纳米斗篷的抗氧化和抗炎特性。预实验表明20 μg mL⁻¹为最低有效安全浓度。荧光显微镜和流式细胞术显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man将RAW 264.7细胞内ROS荧光降至PBS组的7.6%，流式检测残余ROS信号仅为6.3%。BMDMs中观察到类似趋势。ELISA结果证实，该纳米斗篷显著降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同时升高抗炎介质IL-10和TGF-β。Western blot分析显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man有效抑制M1标志物iNOS、COX-2和TNF-α，同时上调M2标志物CD206，表明成功将巨噬细胞重编程为抗炎表型。与临床常用抗炎药地塞米松（Dex）相比，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man表现出更强的ROS清除活性和更显著的M2极化促进作用。CCK-8实验表明即使在160 μg mL⁻¹浓度下，各组细胞活力仍高于70%，具有良好的细胞相容性。

图5. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man在RAW 264.7细胞和BMDMs中的ROS清除和抗炎作用。a) 实验设计示意图；b,h) LPS刺激的RAW 264.7细胞和BMDMs经PBS、H-151、H-151-Cu/Zn-MOF、H-151-Cu/Zn-MOF@LM和H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man处理后DCFH-DA染色的荧光图像，比例尺100 μm；c,i) 细胞内ROS荧光强度定量分析；d,j) DCFH-DA检测细胞内ROS水平的流式细胞术图；e,k) 流式细胞术数据定量分析；f,l) 各组细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β）的ELISA分析；g,m) M1标志物（iNOS、COX-2和TNF-α）及M2标志物CD206的Western blot分析。

（5）EAU小鼠体内治疗效果与免疫调节

使用实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠模型验证治疗效果。C57BL/6J小鼠经IRBP免疫诱发EAU，于免疫后第7至13天每日尾静脉注射给药。剂量优化实验选择100 μg mL⁻¹用于后续研究。临床评估显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man治疗组小鼠前节炎症显著缓解，虹膜结构保持，睫状充血减轻，眼底病变减少。病理分析显示，该治疗显著减少视网膜折叠、脱离和炎性细胞浸润。Western blot显示紧密连接标志物ZO-1表达明显恢复，Evans Blue渗漏实验证实血管屏障功能改善。DHE染色显示视网膜ROS水平显著降低。流式细胞术分析表明，该纳米斗篷显著降低促炎Th1（CD4⁺IFN-γ⁺）和Th17（CD4⁺IL-17A⁺）细胞比例，同时增加调节性T细胞（CD4⁺Foxp3⁺），有效重建免疫稳态。与地塞米松相比，二者总体疗效相当，但纳米斗篷具有更优的系统安全性。

图6. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man在EAU小鼠中的体内治疗效果和免疫调节。a) EAU小鼠治疗方案示意图；b) 健康对照组和经不同治疗后EAU小鼠的前节炎症代表性图像；c) EAU严重程度定量评分；d) 各组代表性眼底图像；e) 各组视网膜H&E染色图像，比例尺200 μm；f) 基于病理学的EAU严重程度定量评估；g) 视网膜组织中ZO-1的Western blot结果及定量分析；h) Evans Blue检测各组视网膜血管渗漏，比例尺200 μm；i) 各组视网膜切片的DHE染色显示ROS水平，比例尺100 μm；j) 脾淋巴细胞中Th1、Th17和Treg细胞群的流式细胞术图及定量分析。

（6）炎症微环境调控与巨噬细胞/小胶质细胞极化

进一步分析EAU小鼠视网膜、脾脏和血清中的关键炎症细胞因子。ELISA结果显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man显著抑制视网膜、脾脏和血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23，同时提升IL-10和TGF-β水平，在所有检测组织中均表现出优于其他治疗组的调节效果。视网膜铺片IBA1免疫荧光染色显示，EAU小鼠小胶质细胞/巨噬细胞呈激活的阿米巴样形态，细胞体增大、突起回缩、IBA1荧光强度增加；经纳米斗篷治疗后，IBA1⁺细胞数量和激活水平显著降低，形态恢复为静息的分支状。视网膜切片显示，EAU小鼠中激活的小胶质细胞和巨噬细胞从内层视网膜向外层迁移，该现象经治疗后明显减轻。Western blot定量分析证实，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man显著抑制M1相关蛋白（iNOS、COX-2、TNF-α）并促进M2标志物CD206表达。

图7. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man对EAU小鼠炎症微环境和巨噬细胞/小胶质细胞极化的调控。a) 治疗后EAU小鼠视网膜、脾脏和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-10和TGF-β的ELISA分析；b) H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man治疗前后EAU小鼠视网膜表型示意图；c) 视网膜铺片免疫荧光染色和视网膜切片显示IBA1染色图像，比例尺100 μm；d) 视网膜组织中M1标志物（iNOS、COX-2和TNF-α）及M2标志物CD206的Western blot及定量分析。

（7）眼部与淋巴结靶向能力

为评估眼部递送潜力，首先构建体外外血-视网膜屏障（oBRB）Transwell模型（TEER > 300 Ω·cm²）。在非炎症条件下，H-151-Cu/Zn-MOF@LM和H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man均表现出可测量的跨RPE单层转运能力，显著高于H-151-Cu/Zn-MOF，其中甘露糖修饰组转运效率最高。在H₂O₂存在时，转运效率进一步提升。正常小鼠眼切片显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man组在RPE区域出现清晰的Cy5荧光，而游离药物组几乎无荧光。

在EAU小鼠中，视网膜铺片成像显示Cy5荧光仅在膜包被组中可见，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man组荧光强度最高，且IBA1染色减少。共定位分析证实Cy5信号与IBA1⁺细胞显著重叠，甘露糖修饰组共定位系数达0.79。眼切片显示，该纳米斗篷具有更深的组织穿透能力，信号分布于外核层（ONL）、内核层（INL）和神经节细胞层（GCL），且在RPE层最强。活体成像显示游离Cy5在12 h内快速清除，而纳米斗篷可持续至48 h。值得注意的是，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man在EAU小鼠腹股沟淋巴结中表现出强荧光积累，而其它组未见此现象。离体器官成像显示纳米颗粒主要在肝脏积累。LC-MS定量显示，纳米斗篷组视网膜H-151浓度达26.73 ng/g，而游离H-151组低于检测限；淋巴结中H-151积累量约为游离药物组的5倍。

图8. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man在EAU小鼠中的眼部组织和淋巴结靶向。a) 分析视网膜铺片和眼切片的实验流程图；b) 视网膜铺片荧光图像显示Cy5标记的纳米颗粒（红色）和IBA1⁺巨噬细胞/小胶质细胞（绿色），比例尺2 mm、100 μm和50 μm；c) 眼切片荧光图像显示Cy5标记的纳米颗粒（红色）及其与IBA1⁺细胞（绿色）的共定位，比例尺50 μm和25 μm；d) 静脉注射Cy5标记纳米颗粒后EAU小鼠不同时间点的活体荧光成像；e) 全身成像荧光强度随时间变化；f) 视网膜铺片Cy5荧光定量分析；g) 注射后48 h主要器官（心、肝、脾、肺、肾和淋巴结）的离体成像；h) 眼切片中视网膜各层Cy5荧光定量分析；i) 淋巴结荧光强度定量测量。

（8）STING-NF-κB轴抑制的机制研究

为阐明分子机制，对LPS刺激的BMDMs和EAU小鼠视网膜组织进行转录组测序。BMDMs中鉴定出2964个差异表达基因（DEGs），视网膜中鉴定出955个DEGs。交集分析发现302个共同下调基因，GO富集显示其主要参与先天免疫调节、II型干扰素反应和细胞因子介导的信号传导。KEGG通路分析表明这些基因与NOD样受体信号、TNF信号、JAK-STAT、IL-17、T细胞受体信号以及胞质DNA感应和NF-κB信号通路相关。GSEA显示，胞质DNA感应通路和NF-κB信号通路在两组数据中均显著富集（BMDMs中NES分别为−1.932和−1.860；视网膜中NES分别为−1.869和−2.022）。

Western blot验证显示，H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man显著降低BMDMs和视网膜中STING、TBK1、p-TBK1、p65和p-p65的蛋白水平。免疫荧光显示，STING表达特异性定位于IBA1⁺激活的巨噬细胞/小胶质细胞，治疗后其表达显著降低。这表明H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man通过联合抑制STING-TBK1-NF-κB通路，在多个水平上调节免疫反应，减少促炎细胞因子活性，恢复免疫平衡，从而协同解决局部和全身炎症。

图9. H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man抗炎和免疫调节作用的机制研究。a) LPS刺激的BMDMs和EAU小鼠视网膜RNA测序实验设计；b) BMDMs和视网膜中PBS组与H-151-Cu/Zn-MOF@LM@Man组差异表达基因（DEGs）的火山图；c) BMDMs和视网膜中DEGs的热图；d) BMDMs和视网膜共同下调基因的Venn图；e) 共同下调DEGs的GO富集分析；f) 下调DEGs的KEGG通路富集分析；g) KEGG富集术语与相关下调基因的弦图；h) 胞质DNA感应通路和NF-κB信号通路的GSEA结果，NES为标准化富集得分；i,j) BMDMs和视网膜中STING、TBK1、p-TBK1、p65和p-p65的Western blot及定量分析；k) 视网膜STING（红色）和IBA1（绿色）的代表性免疫荧光图像，比例尺100 μm；l) 涉及的作用机制和信号通路示意图。