（1）PSB产氢水凝胶的设计、表征与体外抗氧化能力

研究团队采用猪真皮脱细胞ECM制备可注射水凝胶，并将PSB封装其中。流变学测试表明，PSB水凝胶具有典型的非牛顿剪切变稀（假塑性）行为和自修复特性，屈服点为108.5 Pa，计算得出的最大注射压力为150.875 Pa，表明其易于通过微创方式注射至心包腔（图1b）。SEM图像显示，PSB紧密附着于ECM纤维并嵌入网络内部，且水凝胶网络可有效限制细菌逃逸（图1c）。共聚焦显微镜轨迹追踪证实，ECM封装显著约束了PSB的运动，使其局限于网络域内（图1d）。产氢效率优化实验确定，当ECM浓度为5 mg ml⁻¹、PSB浓度为1×10⁸ CFU ml⁻¹、光照强度为10,000–11,000 Lux时，体系可持续高效产氢；即使在光照30分钟后转入暗适应，仍能检测到氢气释放（图1e）。超声成像进一步直观证实了水凝胶在体内的产氢过程（图1f）。在Transwell共培养体系中，PSB水凝胶在光照10分钟内即可显著降低受损H9c2细胞的ROS水平，30分钟恢复至正常范围（图1g），证实其快速抗氧化应激能力。图1h展示了整体治疗机制：心包腔注射后，PSB在光照下释放H₂，选择性清除·OH并调节线粒体动力学。

图1. 可注射产氢细菌水凝胶的设计、表征与治疗机制。a) 由猪真皮ECM和光合细菌组成的产氢细菌水凝胶疗法示意图。b) 可注射水凝胶的流变学表征：储能模量（G′）、损耗模量（G′′）、流变曲线、粘度（η）曲线、剪切应力（τ）和触变性。c) PSB封装于ECM网络中的代表性SEM图像，三个放大插图显示纤维网孔与细菌相对尺寸决定的典型封装状态。比例尺，400 nm。d) 有无ECM封装时PSB的运动轨迹；白色方框代表水凝胶封装的细菌，黑色轮廓代表未封装细菌，红线描绘其自由运动轨迹。比例尺，10 μm。e) 最佳光强下PSB的产氢曲线；两组均先光照30 min，随后连续光照或暗适应40 min。f) PSB水凝胶产氢的超声成像；红色箭头指示超声观察下细菌产生的氢气。g) PSB水凝胶处理后不同时间点的ROS水平，使用DCFH-DA检测。比例尺，100 μm。h) 心包腔注射后，水凝胶中的光合细菌在光照下释放H₂，清除·OH并调节线粒体动力学。

（2）PSB水凝胶的体内滞留与持续产氢能力

为实现局部持续供氢，研究团队评估了ECM载体对PSB体内滞留行为的影响。大鼠心包腔注射后72小时的离体荧光成像显示，PSB水凝胶组的荧光信号主要局限于心脏，而游离PSB组已扩散至肝、脾、肺、肾等远端器官（图2a,b）。通过亚甲蓝（MB）褪色法和UV-Vis光谱监测发现，ECM封装后的PSB在6–12小时内仍保持可观的产氢能力，虽随时间推移细菌活力逐渐下降，但足以覆盖I/R损伤急性期的治疗窗口（图2c,d）。进一步通过二维超声心动图在体监测显示，心包腔注射PSB水凝胶后，光照12小时产氢信号最强，随后逐渐减弱，与体外结果一致（图2e–g）。这些结果表明，ECM水凝胶不仅有效延长了PSB在心肌损伤部位的滞留时间，还确保了治疗关键时间窗内的持续供氢。

图2. PSB水凝胶在大鼠模型中的生物分布与产氢能力。a,b) 心包腔注射后72 h内PSB水凝胶的离体荧光成像（a）及荧光强度统计（b）；n = 6，单因素方差分析（Tukey多重比较）。c) 通过MB法评估PSB水凝胶的产氢效率。d) ECM封装PSB的时间依赖性产氢效率与细菌活力；n = 3，单因素方差分析（Tukey多重比较）。e) 使用超声成像检测体内产氢的示意图。f) 体内产氢的代表性超声图像；红色虚线勾勒大鼠心包腔。比例尺，5 mm（垂直），6 mm（水平）。g) 72 h内体内产氢的定量超声信号分析（ΔEcho强度）；n = 3，非参数Kruskal-Wallis方差分析（Dunn多重比较）。

在大鼠心脏I/R损伤模型中，通过心包腔注射PSB水凝胶并结合光照治疗（PSB + L），显著减轻了心肌损伤并改善了心脏功能。DHE染色显示，治疗组心脏组织ROS水平大幅降低（图3a,b）；TUNEL和WGA染色表明，心肌细胞凋亡和肥大得到有效抑制（图3c–f）。术后7天的斑点追踪超声心动图（STE）分析显示，PSB + L组左室径向位移、径向应变及径向速度峰值均趋于正常化，提示局部室壁运动功能恢复（图3g–j）。长期随访至30天，H&E、Alcian blue、Van Gieson's及Sirius red染色显示，治疗组心肌组织结构更完整，酸性黏多糖积累和胶原瘢痕显著减少（图3m）。Masson三色染色定量分析表明，PSB + L组梗死面积显著缩小，存活心肌比例和梗死壁厚度明显增加（图3n）。超声心动图证实，术后28天治疗组LVEF、LVFS等心功能指标显著改善（图3o）。

图3. PSB水凝胶在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中的治疗效果。a–f) 心脏组织DHE、TUNEL和WGA染色及定量分析；DHE比例尺50 μm，TUNEL比例尺20 μm，WGA比例尺50 μm；n = 10。g) 术后7天左室功能的斑点追踪超声心动图（STE）分析。h–j) 径向位移峰值（h）、径向应变峰值（i）和径向速度峰值（j）；n = 10。k,l) 术后3天（k）和7天（l）心肌组织H&E染色。比例尺，30 μm。m) 术后30天心肌组织病理分析：H&E、Alcian blue、Van Gieson's和Sirius red染色；黑色箭头指示黏液样变性，白色箭头指示胶原瘢痕。比例尺，30 μm。n) Masson三色染色及心肌纤维化、存活心肌和梗死壁厚度定量；n = 10。o) 术后28天超声心动图及LVEF、LVFS、LVIDd和LVIDs定量分析；n = 10。

（4）PSB水凝胶介导的线粒体靶向H₂治疗机制

为进一步阐明H₂的心脏保护机制，研究聚焦线粒体水平。在H9c2细胞中，I/R损伤导致线粒体严重碎片化，而PSB + L治疗后elongated/branched线粒体比例显著增加，碎片化线粒体减少（图4a,b）。JC-1染色显示，治疗组线粒体膜电位（ΔΨm）显著恢复（图4c,d）；mitoSOX荧光证实，线粒体ROS水平明显降低（图4e,f）。Seahorse能量代谢分析表明，PSB + L处理显著提升了线粒体氧化磷酸化（OCR）能力，降低了糖酵解（ECAR）水平，使OCR/ECAR比值恢复正常（图4g,h）。大鼠心肌透射电镜（TEM）观察显示，治疗组线粒体大小、密度及嵴结构均恢复正常（图4i–l）。Western blot分析发现，H₂治疗可恢复线粒体外膜分裂蛋白FIS1的表达水平，提示H₂通过调控FIS1介导的线粒体分裂，重建融合-分裂动态平衡，从而维持线粒体稳态（图4m,n）。

图4. PSB水凝胶治疗后线粒体动力学与功能的恢复。a) MitoTracker Red染色的H9c2细胞共聚焦图像。比例尺，10 μm。b) 线粒体形态分类及定量；n = 3，双因素方差分析（Tukey多重比较）。c) 线粒体膜电位JC-1染色。比例尺，50 μm。d) 线粒体膜电位定量；n = 6，单因素方差分析（Tukey多重比较）。e) 线粒体ROS（mitoSOX，红色）染色。比例尺，10 μm。f) mitoSOX荧光定量；n = 6，单因素方差分析（Tukey多重比较）。g,h) H9c2细胞OCR（g）和ECAR（h）检测；n = 6。i) 大鼠左室心肌线粒体TEM图像；橙色框为放大线粒体，比例尺1 μm（橙色），250 nm（绿色）。j–l) 线粒体大小分布（j）、长度（k）和密度（l）定量；n = 6。m) H9c2细胞及心肌组织中FIS1和MFN2的免疫印迹；n = 3。n) H₂调控线粒体膜稳态的机制示意图。

（5）PSB水凝胶在巴马小型猪模型中的治疗效率与安全性

为验证临床转化潜力，研究采用中国巴马小型猪建立心脏I/R模型（球囊闭塞75 min，再灌注180 min），通过胸腔镜引导进行心包腔微创注射，并以LED光源照射激活产氢。术后2天心脏磁共振（cMRI）显示，PSB + L组无明显心肌损伤信号；术后4周，cMRI显示左室收缩/舒张功能正常化，EF、SV显著改善（图5c–f）。术后12周病理分析显示，与I/R组相比，PSB + L组心肌瘢痕面积显著缩小，凋亡减少，心肌细胞肥大受抑（图5g–j）。连续12周超声心动图监测显示，治疗组LVEF持续显著回升（图5k–m）。安全性方面，术后90天内血常规、血生化、降钙素原（PCT）及主要脏器组织学检查均未发现明显异常，无细菌感染或慢性炎症迹象，证实该细菌水凝胶疗法在大动物模型中兼具疗效与安全性。

图5. PSB水凝胶在猪模型中的治疗效率。a) 猪模型心包腔注射PSB水凝胶治疗心肌I/R损伤的示意图。b) 心功能评估时间线。c) 术后2天心肌LGE-cMRI及术后12周心室切片H&E染色；红色轮廓为钆富集的心肌损伤区。比例尺，30 μm。d) 不可逆心肌损伤的cMRI定量；n = 3，单因素方差分析（Dunnett多重比较）。e) 左室收缩和舒张功能的cMRI评估。f) EF、SV、EDV和ESV的定量；n = 3，双因素方差分析（Tukey多重比较）。g) Masson三色、TUNEL和WGA染色的代表性图像；比例尺30 μm（上、中），20 μm（下）。h–j) 胶原密度（h）、TUNEL阳性率（i）和心肌细胞面积（j）定量；n = 3，单因素方差分析（Dunnett多重比较）。k) 术后12周内超声心动图代表性图像。l,m) LVEF（l）和ΔLVEF（m）的定量分析；n = 3，配对双尾t检验。