方案1. 用于缺血性卒中（IS）后修复的多模态脑组织修复（MP-BTR）平台的设计、制备及多模态治疗机制。（A）血管内皮生长因子受体（VEGFR）靶向血管生成肽（VP）的计算设计。（B）抗炎肽（AF）-PBA肽接枝MP纳米片（MPA）合成过程示意图。（C）PEV/MPA水凝胶通过VP与四臂聚乙二醇马来酰亚胺（PEG-Mal）之间的点击化学反应以及MPA的掺入而形成。PEV/MPA水凝胶通过多模态调控促进IS后组织再生，包括炎症调节、促血管生成、受损组织桥接以及促进神经电信号恢复。

图1. 血管生成肽（VP）的计算设计、结构表征及血管生成潜力。（A）VEGFR靶向肽发现筛选流程。（B）修饰Top1–VEGFR复合物的均方根偏差稳定性。（C）关键结合残基的均方根涨落分析。（D）修饰Top1与VEGFR的相互作用网络。（E）结合位点刚性的B因子分析。（F）修饰Top1的残基相互作用频率。（G,H）Top1与修饰Top1结合模式的结构比较。（I）分子力学/广义Born表面积结合自由能计算。（J）显示β-折叠构象的VP圆二色谱。（K）VP的二级结构组成。（L）VP合成的质谱验证。（M）VP对HUVECs中VEGF-A表达的剂量依赖性效应。

（2）MXene-肽基递送系统的理性构建

为构建炎症响应性释放系统，研究团队将4-羧基苯硼酸（PBA）接枝到抗炎肽AF（MQMKKVLDS）上获得AF-PBA。分子对接显示AF与TNF-α具有强亲和力（最低对接分数−161.51），Asn34与Met1形成2.6 Å氢键。CD和质谱验证了AF-PBA的成功合成。针对MXene在生理条件下易氧化降解的瓶颈，研究采用聚多巴胺（PDA）包覆MXene得到MXene@PDA，但发现其在储存2个月后出现明显氧化、7天内发生聚集。为此，引入纤维素纳米晶（CNC）作为稳定剂获得MP，胶体稳定性提升至2个月以上。进一步将AF-PBA接枝到MP表面获得最终产物MPA，SEM-EDS验证了N（9.48%）和S（0.11%）的存在，AFM显示纳米片高度从1.5–2.0 nm增至4.0–6.0 nm，直接证明了表面功能化的成功。

图2. 分子相互作用分析、肽工程及MXene基复合材料的开发。（A）AF与TNF-α的3D结合姿态。（B）AF-TNF-α氢键网络的2D相互作用图。（C）AF-TNF-α界面的疏水接触残基。（D）用于控制释放的AF-PBA合成示意图。（E）AF和AF-PBA二级结构的圆二色谱。（F）PBA修饰诱导的定量二级结构变化。（G,H）验证AF和AF-PBA分子量的质谱。（I）AF-PBA的抗炎功效。（J）MXene@PDA纳米片合成过程示意图。（K）MXene@PDA的TEM图像。（L）导电材料的紫外-可见光谱验证。（M）新鲜/老化导电材料的拉曼光谱。（N）导电材料与对照（储存2个月）的胶体稳定性及AF-PBA接枝到MP和导电材料稳定性的示意图。（O）通过SEM-EDS验证MPA合成。（P,Q）MXene和MPA的原子力显微镜3D表面形貌图像、原子力显微镜形貌及高度分布。

图3. MP基复合材料的多尺度结构与化学表征。（A–D）MXene、老化MXene、MXene@PDA和MPA的TEM图像（插图：选区电子衍射图案、高分辨TEM图像、快速傅里叶变换图案），揭示层状微观结构。（E）MPA的TEM-EDS元素分布图。（F,G）MXene@PDA和MPA的X射线光电子能谱。（H–L）MXene、老化MXene、MXene@PDA和MPA的Ti⁴⁺含量定量及Ti 2p信号高分辨谱。（M）AF-PBA肽的高斯导出电荷分布。（N,O）MXene–PDA三种不同构型（I–III）及含CNC三元构型（IV）的密度泛函理论模拟。（P）PDA和CNC的高斯导出电荷分布。

（4）MP-BTR平台的构建与功能验证

PEV/MPA水凝胶由PEG、VP和MPA通过点击化学形成，具备优异的可注射性，导电性达1.2 mS/cm（4 mg/mL MPA）。电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）显示其电化学性能显著优于对照组。SEM表明MPA纳米片作为物理交联点，引导PEG链形成更致密均匀的网络。流变学测试显示储能模量（G′）始终大于损耗模量（G″），且模量接近脑组织（0.1–1 kPa），兼具剪切变稀和自修复特性；溶胀率<10%，具有重要临床意义。释放实验显示AF-PBA在炎症条件下（pH 6.5 + H₂O₂）14天累积释放56.75%，而生理条件下（pH 7.4）仅36.24%，实现了炎症响应性控释。细胞实验表明，PEV/MPA细胞相容性>95%，在氧糖剥夺（OGD）条件下显著降低BV2小胶质细胞TNF-α和IL-1β水平，并促进HUVECs血管生成和迁移。

图4. MP-BTR平台的构建与功能验证。（A,B）PEV/MPA水凝胶的制备、可注射性和导电性。（C）水凝胶导电性（1–6 mg/mL MPA）。（D,E）不同水凝胶的电化学阻抗谱和循环伏安曲线。（F）不同水凝胶的比较SEM微观结构分析。（G–I）不同水凝胶的频率依赖性粘弹性能、应变振幅依赖性剪切变稀行为和自修复性能。（J）水凝胶在生理缓冲液中的溶胀率（储存7天）。（K）生理/病理条件下的控制释放动力学。（L,M）水凝胶与HT22和BV2共培养48小时后的细胞活力。（N–P）OGD后水凝胶与BV2小胶质细胞共培养48小时TNF-α和IL-1β水平的代表性免疫荧光图像和定量分析。（Q–S）OGD后水凝胶与HUVECs共培养48小时荧光素二乙酸酯染色管的代表性图像及管长度和连接点的定量。（T）OGD及指示处理后HUVECs划痕试验的半定量分析。

（5）MP-BTR平台的体外细胞调控机制

JC-1荧光染色显示，PEV/MPA能够恢复OGD诱导的HT22神经元线粒体膜电位下降，表明其可缓解线粒体功能障碍。ELISA和免疫荧光分析进一步揭示，PEV/MPA通过三大机制发挥细胞保护作用：（I）激活内源性抗氧化防御系统，下调4HNE并上调Nrf2表达；（II）调节炎症微环境，显著下调促炎因子TNF-α、IL-1β和NLRP3炎症小体；（III）创造促血管生成微环境，显著上调HUVECs中VEGF-A和CD31的表达。这些结果初步证明了MP-BTR平台集成导电、抗炎和促血管生成功能后的多模态调控能力。

图5. MP-BTR平台体外调控细胞功能。（A,B）用于评估线粒体膜电位（MMP）的JC-1共聚焦图像，及OGD后水凝胶与HT22细胞共培养48小时MMP的半定量分析。（C–H）OGD后水凝胶与BV2细胞和HUVECs共培养48小时的酶联免疫吸附测定。（I–K）OGD后水凝胶与HUVECs共培养48小时VEGF-A和CD31水平的代表性免疫荧光图像和定量分析。（L,M）水凝胶介导细胞调节的示意图。

（6）MP-BTR平台协同重塑缺血微环境

在光血栓（PT）模型小鼠中，PEV/MPA治疗显著降低急性期脑水肿，减少梗死体积，且材料在35天内完全降解。TEM显示，14天注射后（dpi）PEV/MPA组脑组织线粒体结构接近正常，嵴密度与假手术组相当。免疫荧光显示，PEV/MPA显著降低氧化应激标志物4HNE，上调Nrf2；减少IBA1⁺小胶质细胞数量，恢复细胞形态，并几乎完全抑制NLRP3和IL-1β表达。激光散斑对比成像显示，PEV/MPA组脑血流灌注显著恢复，梗死体积减小；免疫组化显示VEGF-A和CD31表达水平在所有组中最高。此外，PEV/MPA组维持神经元核膜完整，内源性神经干细胞标志物Nestin分布最广，成熟神经元Neun⁺细胞密度最高，显示出卓越的神经保护效果。

图6. MP-BTR平台通过调节氧化-炎症级联缓解IS损伤。（A）体内治疗评估实验时间线。（B）3和7天注射后（dpi）通过比重法测量的脑水肿。（C）3 dpi的H&E染色脑切片。（D）MP-BTR的体内生物降解照片和效率。（E）14 dpi脑组织线粒体结构的TEM图像。（F–I）3 dpi脑组织中4HNE、Nrf2、IBA1和NLRP3的表达水平。（J）14 dpi脑组织中VEGF-A的表达水平。（K）14 dpi脑组织中巢蛋白（nestin）的表达水平。（L–N）3 dpi脑组织中4HNE、Nrf2、IBA1、IL-1β和NLRP3的代表性免疫染色图像。（O）14 dpi小鼠脑激光散斑图像。（P）14 dpi脑组织中VEGF-A的代表性免疫染色图像。（Q）14 dpi脑组织神经元核完整性的TEM图像。（R）14 dpi脑组织中nestin的代表性免疫染色图像。

（7）神经血管单元完整性修复与胶质瘢痕抑制

21 dpi时的超微结构和免疫荧光分析显示，PEV/MPA组血脑屏障（BBB）内皮连接紧密、基底膜连续、星形胶质细胞足突形态接近正常；突触前囊泡分布规律、突触后密度清晰、突触间隙宽度正常。病理蛋白聚集方面，PEV/MPA显著抑制Tau和α-突触核蛋白（α-Syn）的异常聚集。髓鞘完整性评估显示，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）与髓鞘相关糖蛋白（MAG）共定位指数（Pearson's R = 0.81 ± 0.02）接近假手术组，表明髓鞘结构得到良好修复。此外，PEV/MPA恢复了间隙连接蛋白CX43的网络架构，将S100β降至生理水平；并显著减少GFAP和硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）的表达面积，有效抑制反应性胶质增生和胶质瘢痕形成，为神经再生创造了 permissive 微环境。

图7. MP-BTR平台通过恢复血脑屏障（BBB）-髓鞘-突触轴和抑制反应性胶质增生修复缺血性损伤。（A,B）21 dpi BBB和突触的TEM分析。（C–F）21 dpi脑组织中Tau、α-突触核蛋白（α-Syn）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、连接蛋白43（CX43）、S100β、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）的代表性免疫染色图像。（G–J）21 dpi Tau、α-Syn、MOG/MAG、CX43、S100β、GFAP和CSPG的表达水平。

（8）神经功能重塑与电生理活动恢复

行为学评估显示，PEV/MPA组小鼠在旷场测试中运动距离显著增加，转棒掉落时间接近300秒，改良神经功能缺损评分（mNSS）下降最快；足印追踪显示步长、步态对称性和肢体协调均接近假手术组。在神经电生理层面，21 dpi时PEV/MPA组刺激诱发局部场电位（LFP）的潜伏期接近假手术水平；颅骨螺钉EEG记录显示，delta（0.3–3 Hz）和theta（4–7 Hz）波段活动显著恢复，频谱模式接近正常，表明MPA中工程化MXene在生理环境中表现出更稳定的导电性，有效促进了细胞间电信号传导。TEM进一步揭示，PEV/MPA组髓鞘致密性良好，层间分离和水肿显著减少，为电生理恢复提供了结构基础。

图8. MP-BTR平台重塑IS损伤后的神经功能。（A）21 dpi小鼠旷场测试图像。（B）旷场测试中小鼠的总运动距离。（C,D）治疗过程中小鼠的转棒掉落时间和改良神经功能缺损评分。（E）21 dpi小鼠的代表性足印追踪图像。（F）21 dpi从缺血损伤脑区记录的代表性刺激诱发局部场电位（LFP）波形。（G）21 dpi小鼠的代表性脑电图（EEG）记录（原始EEG波形、EEG振幅、EEG频谱图）。（H,I）EEG实验图像和神经信号恢复示意图。（J）21 dpi脑组织髓鞘的TEM图像。

（9）机器学习驱动的核心调控靶点识别

21 dpi的转录组学分析显示，PEV/MPA与PT组相比存在大量差异表达基因（DEGs），GO富集分析提示炎症免疫、血管生成、髓鞘形成及突触可塑性相关通路显著激活。加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出与PEV/MPA治疗最相关的绿色关键模块。进一步采用LASSO回归和随机森林（RF）机器学习算法，识别出Kdr、Akt2、Sesn2、Aif1（编码IBA1）和Trem2为核心调控基因。RF模型预测性能最优（AUC = 0.825）。相关性分析揭示Sesn2与Akt2负相关（氧化应激）、Kdr与Akt2正相关（血管生成）、Aif1与Trem2正相关（神经炎症），提示Akt2是连接多条通路的调控枢纽。Western blot验证PEV/MPA可下调NLRP3、IL-1β、IBA1并上调Nrf2。

图9. 整合生物信息学和机器学习分析鉴定与MP-BTR平台相关的关键基因和生物学过程。（A）PEV/MPA与PT组差异表达基因（DEGs）的火山图。（B）前20个富集生物学过程术语的基因本体（GO）弦图。（C）关键炎症相关通路的GO富集气泡图。（D）基因的加权基因共表达网络分析（WGCNA）聚类树状图。（E）模块-特征相关性热图。（F）绿色模块中基因显著性与模块成员关系的散点图。（G）随机森林（RF）分析中顶级基因的重要性排序。（H）比较RF、逻辑回归和支持向量机（SVM）模型预测性能的受试者工作特征（ROC）曲线。（I）校准曲线中RF模型的标识及其Brier评分。（J）与氧化应激相关的Sesn2与Akt2表达水平的相关性分析。（K）与血管生成相关的Kdr与Akt2表达水平的相关性分析。（L）与神经炎症相关的Aif1（编码IBA1）与Trem2表达水平的相关性分析。（M）各治疗组关键炎症（NLRP3、IL-1β、TNF-α和IBA1）和抗氧化（Nrf2）标志物的蛋白质印迹分析。（N）MP-BTR调控机制中提出的信号通路示意图。

（10）代谢稳态恢复与磷脂酶D信号轴调控

PT模型小鼠在恢复期间出现显著的毛发变黄和进行性体重下降表型，而PEV/MPA组未出现该现象且体重有效恢复。非靶向代谢组学分析显示，PEV/MPA显著富集铁死亡、坏死性凋亡、胞葬作用、磷脂酶D信号通路、AMPK/mTOR及氨基酸代谢等通路。关键代谢物相关性分析表明，神经元健康标志物N-乙酰-L-天冬氨酸与促炎分子花生四烯酸呈显著负相关，而花生四烯酸与神经递质L-谷氨酸亦呈负相关。联合转录组-代谢组分析进一步揭示，磷脂酶D信号通路在基因和代谢物水平均显著富集，提示该通路作为连接细胞膜损伤与下游炎症反应的关键上游驱动因子，在MP-BTR平台的代谢重塑中发挥重要作用。

图10. 整合转录组学和代谢组学分析提示MP-BTR平台的免疫调节和代谢重塑机制。（A）毛发色素沉着代表性表型观察。（B）差异代谢物的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。（C）体重恢复轨迹。（D）指示组比较中差异代谢物的定量。（E）指示组比较中差异代谢物数量的韦恩图。（F–H）关键代谢物之间的相关性分析。（I）差异基因和代谢物中前15个共同富集的KEGG通路。