针对上述问题，安徽医科大学钱海生与徐令令团队开发了一种可穿刺植入的明胶甲基丙烯酰干凝胶（CMF IMP），负载铜锰氧化物纳米颗粒和单甲基富马酸，实现肿瘤内长效药物释放。该植入物通过双重机制激活抗肿瘤免疫：一方面诱导肿瘤细胞发生铜死亡并促进线粒体DNA释放，另一方面协同激活cGAS-STING免疫信号通路和免疫原性细胞死亡，从而重塑肿瘤微环境，增强T细胞和NK细胞浸润，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。与PD-1抗体联合使用可显著抑制乳腺癌原发灶和肺转移灶，提高小鼠生存率，为实体瘤的局部免疫治疗提供了新策略。该文章于2025年7月24日以《Gelatin Methacryloyl Xerogel Puncture Implants Loaded with Cu_0.5Mn_2.5O₄ Nanoparticles Synergizes Cuproptosis and STING Activation for Enhanced Breast Cancer Immunotherapy》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c09491）。

研究示意图

（1）CMO纳米颗粒与 CMF IMP的制备与表征

CMO NPs经水热法合成，透射电镜（TEM）显示其呈均匀空心球形结构，粒径约300 nm（图1b,c），与动态光散射结果一致；X射线衍射（XRD）图谱与标准卡片（Cu₀.₅Mn₂.₅O₄, JCPDS 7-4367）特征峰吻合，证实成功合成（图1d）；元素mapping显示Cu、Mn、O均匀分布于纳米颗粒；CMO NPs具备优异的谷胱甘肽（GSH）消耗能力（图1e），与其多价金属离子特性相关。植入物制备采用3D打印模具，将GelMA与CMO NPs、MMF混合后经紫外光交联、冻干得CMF IMP（图1a）。手机相机与扫描电镜（SEM）显示植入物呈规则圆柱形，可装入活检针（图1f-h）；长度约2 mm，宽度约0.9 mm，重量约0.5 mg（图1i,k），垂直方向压缩力足以刺入肿瘤（图1l）。电感耦合等离子体（ICP）与元素mapping定量显示每根植入物含约20 μg Cu与6 μg Mn，分布均匀（图1m,n）。罗丹明B标记的植入物体内成像显示，其在肿瘤内缓慢降解至少15天，有利于药物持续释放（图1o）。

图1. CMO NPs和CMF IMP的制备与表征。（a）CMF IMP制备方法示意图；（b）CMO NPs的TEM图像；（c）粒径分布拟合曲线；（d）XRD图谱；（e）DTNB法测定CMO NPs对GSH的浓度依赖性消耗；（f,g）CMF IMP的智能手机照片；（h）CMF IMP的SEM图像；（i）CMF IMP的长度和宽度；（j）使用穿刺针将CMF IMP递送至肿瘤内部的示意图；（k）CMF IMP的重量；（l）CMF IMP垂直方向的压缩力；（m）CMF IMP的ICP及（n）元素分布图像；（o）小鼠肿瘤内植入物不同时间点的成像。

（2）CMF-吲哚胺（IMP）可诱导4T1细胞发生凋亡及铜死亡

CMO纳米颗粒被内化至细胞质中，且与线粒体位置紧密相邻（图2a）。CMO纳米颗粒与MMF均对4T1细胞活力表现出明显的浓度依赖性效应（图2b）。经 CMF IMP处理的4T1细胞中G1期细胞数量增加，而G2/M期细胞数量显著减少（图2c，d）。CMOIMP和 CMF IMP处理显著提高了4T1细胞的早期和晚期凋亡率（图2e，f）。CMOIMP和 CMF IMP处理显著增加了肿瘤球体中凋亡细胞的数量（图2h）。CMO纳米颗粒进入细胞后会释放铜离子（图2g），导致线粒体膜电位降低（图2i）。多种氧化态的金属离子（如Cu²⁺、Mn⁴⁺和Mn³⁺）展现出优异的 GSH 耗竭能力（图2j），经 CMF IMP处理的4T1细胞呼吸储备能力明显减弱（图2k），存在严重线粒体损伤（图2l）,铜离子与乙酰化三羧酸循环蛋白的结合导致二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）乙酰化依赖性寡聚化（图2m）。

图2. CMF IMP诱导4T1细胞凋亡和铜死亡。（a）CMO NPs内化至4T1细胞的Bio-TEM图像；（b）细胞活力；（c,d）细胞周期；（e,f）凋亡流式细胞术分析；（g）Cu²⁺检测；（h）活/死细胞染色；（i）线粒体膜电位；（j）GSH检测；（k）OCR及最大呼吸；（l）线粒体Bio-TEM图像；（m）DLAT的Western blot。

（3）对经PBS或 CMF IMP处理的4T1细胞进行RNA-seq分析

为阐明CMF IMP影响4T1细胞的机制，对对照组和CMF IMP组进行RNA转录组测序分析。维恩图显示两组共表达14029个基因，CMF IMP组特异性表达1469个基因（图3a）。差异表达基因的火山图显示351个基因上调、364个基因下调（图3b）。热图突出显示铜死亡相关基因（Lias、Dld、Mt1/2、Slc30a1、Pdhb和Bcl2）及cGAS-STING通路相关基因（Cgas、Tbk1）的显著变化（图3c）。基因集富集分析表明CMF IMP处理显著抑制4T1细胞的糖酵解和糖异生（图3d）。KEGG和GO分析显示，内质网蛋白质加工、抗原加工与呈递、cGMP-PKG信号通路、谷胱甘肽代谢过程、铜离子应激反应及T细胞介导的细胞毒性均被激活（图3f,g）。

图3. 经PBS或 CMF IMP处理的4T1细胞RNA测序分析。(a)维恩图展示4T1细胞中表达基因的数量。(b)火山图呈现差异表达基因(DEGs)。(c)相关基因表达热图分析。(d，e) GSEA 显示 CMF IMP处理组细胞中糖酵解、糖异生及内质网蛋白质加工相关基因显著富集。(f)DEGs的 KEGG 通路分析。(g)DEGs的GO富集分析。

（4）CMF IMP在体外可诱导抗肿瘤免疫应答

采用激光共聚焦双光子成像系统观察不同植入物制剂处理后4T1细胞的mtDNA释放情况。对照组和Blank IMP组的mtDNA荧光与线粒体荧光基本重叠，表明mtDNA滞留在线粒体内；而MMF IMP、CMO IMP和CMF IMP组的mtDNA荧光部分偏离线粒体荧光，提示mtDNA从线粒体释放至细胞质（图4a）。定量分析显示，MMF IMP和CMO IMP组细胞质中mtDNA含量约为对照组的5倍，CMF IMP组高达17倍（图4b）。CMO IMP和CMF IMP处理显著增加4T1细胞ATP释放，上调细胞膜上CRT表达，降低细胞核内HMGB1含量（图4c-f、S8）。CMO IMP和CMF IMP组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著升高，提示炎症发生（图4g-i）。IFN-β mRNA表达水平增加表明cGAS-STING通路激活（图4j）。Transwell实验显示，CMO IMP和CMF IMP组BMDCs中IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平显著升高，促进BMDCs成熟并增强T细胞抗肿瘤活性（图4k）。流式细胞术证实处理后BMDCs成熟度显著增加（图4m）。

图4. CMF IMP诱导体外抗肿瘤免疫反应。（a）mtDNA和线粒体荧光图像；（b）mtDNA释放量；（c）ATP释放；（d）CRT和HMGB1免疫荧光及（e,f）定量分析；（g-j）TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β水平；（k）共培养示意图；（l）BMDCs中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌；（m）BMDCs成熟度流式分析。

（5）CMF IMP在乳腺癌体内治疗中的应用分析

差异表达基因的火山图和热图分析显示，与对照组相比，CMF IMP组1948个基因显著上调、527个基因下调（图6a）。CD274基因显著下调而PDCD1基因显著上调，提示CMF IMP与αPD-1联合治疗的潜在协同效应（图5b）。KEGG通路分析显示差异表达基因与HIF-1、MAPK和NF-κB信号通路等抗肿瘤免疫相关（图5c）。建立乳腺癌原位小鼠模型验证CMF IMP联合αPD-1的抑瘤效果，小鼠随机分为7组：对照组、Blank IMP组、MMF IMP组、CMO IMP组、αPD-1组、CMF IMP组及CMF IMP & αPD-1联合组（图5e）。小动物成像结果显示CMF IMP联合αPD-1组肿瘤荧光面积最小，疗效最佳（图5d）。治疗期间小鼠体重稳定（图5f）。治疗后CMF IMP & αPD-1组平均肿瘤体积为294.7 mm³，仅为CMF IMP组（651.3 mm³）的45.2%（图5g,h）。治疗后50天，CMF IMP & αPD-1组小鼠存活率保持100%，CMF IMP组为62.5%（图5i）。肿瘤组织切片显示显著消退，包括Ki67增殖标志物减少、坏死区域增加、DNA损伤及DLAT表达升高（图5j）。

图5. CMF IMP体内治疗乳腺癌分析。（a）差异表达基因火山图；（b）基因热图；（c）KEGG通路分析；（d）各组小鼠不同时间点生物发光成像；（e）乳腺癌小鼠模型构建及治疗方案示意图；（f-h）治疗期间小鼠体重和肿瘤体积变化曲线；（i）50天治疗期内小鼠生存曲线；（j）肿瘤组织切片Ki67、H&E、TUNEL和DLAT的免疫组化及免疫荧光染色分析。

（6）体内 CMF 免疫检查点抑制剂（IMP）激活抗肿瘤免疫反应机制的分析

Western blot分析显示CMF IMP显著上调cGAS-STING通路下游蛋白（图6a）。ELISA分析显示CMF IMP处理显著增加肿瘤组织中免疫激活细胞因子水平（图6b）。流式细胞术分析显示，与对照组相比，CMF IMP和αPD-1处理组肿瘤中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞（CD3-CD49b+）和B细胞（CD3-CD19+）比例增加（图S15）。CD8+ T细胞和NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α显著增加（图6c-f）。CMF IMP和αPD-1处理促进DCs浸润和成熟（图6g,h）。CMF IMP和αPD-1诱导TNF-α和IFN-γ等促炎因子产生，促进M2样巨噬细胞向M1样巨噬细胞重编程（图6i,j）。CMF IMP和αPD-1处理组Treg细胞和MDSCs数量显著低于对照组（图6k,l）。

图6. CMF IMP激活体内抗肿瘤免疫反应机制分析。（a）cGAS-STING通路蛋白Western blot分析；（b）肿瘤组织CXCL-10、IFN-γ、TNF-α和IFN-β的ELISA检测；（c,d）CD4+T细胞、CD8+ T细胞、IFN-γ+CD8+ T细胞和TNF-α+CD8+ T细胞的流式细胞术分析；（e,f）NK细胞、IFN-γ+NK细胞、TNF-α+ NK细胞和B细胞的流式细胞术分析；（g,h）DCs和成熟DCs的流式细胞术分析；（i,j）M1样和M2样巨噬细胞的流式细胞术分析；（k,l）Treg细胞和MDSCs的流式细胞术分析。

（7）分析 CMF IMP与 αPD -1对远处肿瘤的抑制作用

双侧肿瘤模型构建及治疗方案见图7a，分为未处理原发肿瘤（UP）/未处理远端肿瘤（UD）组和已处理原发肿瘤（TP）/已处理远端肿瘤（TD）组。治疗期间小鼠体重无显著变化（图7b），治疗组原发和远端肿瘤部位的肿瘤重量均显著降低（图7c），代表性肿瘤图像见图7d。治疗组肿瘤生长速率显著受抑，部分小鼠远端肿瘤完全消退（图7e,f）。治疗后原发和远端肿瘤中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、DCs和B细胞浸润显著增加（图7g-m）。CMF IMP和αPD-1处理后，原发和远端肿瘤中M2样巨噬细胞均向M1样巨噬细胞转化（图7h,n），Treg细胞和MDSCs等免疫抑制细胞比例显著降低（图7i,o）。

图7. CMF IMP和αPD-1对远端肿瘤的抑制效果分析。（a）远端肿瘤建立及治疗示意图；（b）治疗期间小鼠体重变化曲线；（c）治疗后肿瘤重量；（d）不同处理后小鼠肿瘤代表性图像；（e,f）治疗期间小鼠肿瘤体积变化曲线；（g,j）CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞的流式细胞术分析；（k-m）DCs、成熟DCs和B细胞的统计分析；（h,n）M1样和M2样巨噬细胞的流式细胞术分析；（i,o）Treg细胞和MDSCs的流式细胞术分析。

（8）CMF IMP与 αPD -1对肺转移瘤抑制作用的分析

小鼠乳腺癌肺转移模型的建立及治疗见图8a。治疗期间CMF IMP和αPD-1处理组小鼠体重保持稳定，对照组小鼠体重在实验后期略有下降（图8b）。对照组肿瘤发展迅速，第20天平均肿瘤体积达1288 mm3，而CMF IMP和αPD-1处理组仅为288 mm3（图8c）。对照组肺组织呈暗红色，布满乳腺癌肺结节；处理组肺组织呈粉红色，肺结节数量显著减少（图8d）。对照组肺/体重比显著高于处理组，提示肺组织积聚大量乳腺癌细胞（图8e）。H&E染色显示对照组肺组织乳腺癌转移灶数量显著多于处理组（图8f）。与对照组相比，处理组肺组织中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞和成熟DCs比例显著增加（图8g）。CD8⁺ T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性显著增强，IFN-γ和TNF-α分泌增加（图8h,i）。

图8. CMF IMP和αPD-1对肺转移肿瘤的抑制效果分析。（a）肺转移肿瘤建立及治疗示意图；（b,c）治疗期间小鼠体重和肿瘤体积变化曲线；（d）不同处理后小鼠肺组织代表性图像；（e）不同处理后肺/体重比；（f）肺组织切片H&E染色；（g）CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞的流式细胞术分析；（h）IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞和TNF-α⁺CD8⁺ T细胞的流式细胞术分析；（i）IFN-γ⁺ NK细胞和TNF-α⁺ NK细胞的流式细胞术分析。