针对上述问题，中山大学附属第一医院烧伤与创面修复科胡志成、唐冰、朱嘉元团队联合多中心构建的SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE多功能水凝胶系统，以甲基丙烯酸化丝素蛋白（SFMA）与甲基丙烯酸化重组III型胶原蛋白（rCol3MA）为双网络基质，嵌入ROS响应性脂质纳米颗粒（LNPs）共载AMP与PUE，利用创面高ROS微环境触发LNPs解体实现药物按需释放，同步发挥抗菌、抗炎、促血管新生与抗氧化应激四重功能。该仿生平台首次将"ROS响应型脂质体智能释药"概念融入糖尿病创面水凝胶设计，为慢性难愈感染性创面提供了一种简便、高效、可临床转化的多功能敷料新策略，同时拓展了中药活性成分与现代生物材料在再生医学中的协同应用框架。该文章于2024年9月23日以《A ROS-Responsive Lipid Nanoparticles Release Multifunctional Hydrogel Based on Microenvironment Regulation Promotes Infected Diabetic Wound Healing》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202403219）。

图1. 多功能水凝胶SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE的设计与加速创面愈合机制示意图

（1）LNPs与水凝胶基质的化学结构及微观形貌表征

为实现ROS响应性药物递送，研究团队首先合成两亲性聚合物PHB-DEX：以羰基二咪唑（CDI）活化4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯（PBAP），再与葡聚糖（DEX）侧链羟基反应，引入对ROS敏感的硼酸酯键。FTIR光谱中PHB-DEX在1748 cm⁻¹处出现碳酸酯基团—O—C═O—O—特征吸收峰，1560、1500及860 cm⁻¹处出现对位取代苯环特征峰；¹H-NMR中苯环氢信号出现在7.33和7.64 ppm，证实PBAP与DEX有效偶联。SFMA的¹H-NMR在5.6和6.0 ppm处出现新丙烯酸质子峰（=CH₂），rCol3MA在5.3和5.6 ppm处出现相应烯键氢吸收峰，确认甲基丙烯酰化修饰成功。

（2）负载ROS响应性LNPs的SFMA/rColMA水凝胶理化性能表征

DLS显示空白LNPs水合粒径为149.3±7.7 nm，PDI为0.175；TEM呈圆形或椭圆形大单室结构，具典型双层膜。载药后LNP@AMP@PUE粒径增至217.7±17.1 nm，PDI为0.182，分散性未受影响，TEM显示结构完整且体积增大。

流变学时间扫描显示G'始终远大于G''且不再随时间变化，表明水凝胶已完全成胶；随rCol3MA质量分数增加，G'显著升高，含3% rCol3MA时储能模量最高。频率扫描（0.1–10 Hz）显示G'与G''基本不随频率变化，线性黏弹区稳定。应力-应变曲线显示最大应力值随rCol3MA增加而升高，但断裂应变降低，SFMA/3%rCol3MA最大压缩强度≈40 kPa。溶胀实验显示所有水凝胶溶胀率介于50%–80%，随rCol3MA浓度增加溶胀率略降，归因于交联密度增大。综合考量机械性能与生物效应，选定10%SFMA/2%rCol3MA进行后续实验。

降解实验显示，含溶菌酶PBS中水凝胶前7天降解速率较高，21天时完全降解；无酶PBS中21天降解>90%，证实良好生物降解性。药物释放曲线显示，H₂O₂环境中AMP与PUE释放速率及累积释放量均显著高于无H₂O₂组，充分体现载体的ROS响应性。

图2. 负载ROS响应性LNPs的SFMA/rColMA水凝胶表征。A）LNPs的粒径分布；B）LNPs的透射电子显微镜（TEM）图像，比例尺=100 nm；C）LNP@AMP@PUE的粒径分布；D）LNP@AMP@PUE的TEM图像，比例尺=100 nm；E）水凝胶的流变学时间扫描曲线；F）水凝胶的流变学频率扫描曲线；G）水凝胶的应力-应变曲线；H）最大应变下压缩模量统计（n=3）；I）水凝胶溶胀曲线（n=3）；J）10%SFMA/2%rCol3MA/LNP@AMP@PUE水凝胶在PBS及含酶环境中的降解曲线（n=3）；K）水凝胶中AMP的累积释放曲线；L）水凝胶中PUE的累积释放曲线。

（3）水凝胶生物相容性与体外抗菌性能评价

Transwell实验显示SFMA/rColMA水凝胶显著促进L929成纤维细胞迁移，与III型胶原引导成纤维细胞迁移的文献报道一致；CCK-8检测表明各水凝胶体系均具良好细胞活力，无显著毒性。

平板计数法显示，含LNP@AMP水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果呈浓度依赖性：100–400 μg·mL⁻¹浓度下对大肠杆菌抗菌率分别为99.56%、99.74%、99.92%，对金黄色葡萄球菌分别为98.79%、99.60%、99.62%。选定200 μg·mL⁻¹ LNP@AMP进行后续实验，SFMA/rColMA/LNP@AMP与SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE对两种细菌的抗菌率均>99%。SEM显示AMP处理后细菌皱缩破裂（白色箭头），其余组形态完整饱满。

图3. 水凝胶体外生物相容性与抗菌能力评价。 A）Transwell实验检测不同组成纤维细胞迁移能力（n=3）；B）L929细胞经不同水凝胶处理24 h和48 h后的细胞活力（n=3）；C、D）含不同浓度LNP@AMP（100、200、400 μg·mL⁻¹）水凝胶处理后存活细菌克隆图像及统计（n=3）；E、F）不同水凝胶处理后存活细菌克隆图像及统计（n=3）；G）不同水凝胶处理后E. coli与S. aureus的SEM图像，白色箭头指示受损破裂细菌，比例尺=1 μm。ns表示无显著性，表示p<<0.01，*表示p<<0.005。

（4）网络药理学分析揭示糖尿病创面与PUE靶点的关联

为阐明PUE与创面微环境的潜在关系，研究团队采用生物信息学方法进行分析。xCell算法计算微环境评分显示：糖尿病足溃疡（DFU）微环境评分与基质评分显著低于正常皮肤，免疫评分显著高于正常皮肤。细胞组分分析显示DFU中巨噬细胞浸润显著增加且以M1型为主，内皮细胞数量显著低于正常组。差异分析共鉴定1583个显著差异表达基因（DEGs），其中356个上调、1227个下调。

从CTD、TCMSP及STP数据库分别获取124、53、95个PUE相关靶点，去重后共234个。这些靶点主要与癌症、感染性疾病、糖尿病等相关。Venn图分析获得DFU-DEGs与PUE靶点交集基因29个。KEGG通路富集显示PUE主要参与HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等，与血管内皮细胞功能调控及巨噬细胞极化密切相关。

图4. 网络药理学分析糖尿病创面与PUE靶点的关联。 A）DFU与正常皮肤的免疫、基质及微环境评分分布；B）DFU与正常皮肤组织中巨噬细胞与内皮细胞比例；C）GSE80178数据集DEGs火山图；D）不同数据库PUE靶点基因汇总；E）靶点基因KEGG通路富集分析结果；F）共同基因Venn图；G）共同基因KEGG通路富集分析结果。*表示p<<0.05。

（5）SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶在ROS失衡微环境中的促血管生成效应

以200×10⁻⁶ M H₂O₂模拟氧化应激ROS微环境，CCK-8显示H₂O₂显著抑制HUVEC活力，而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组恢复效果最显著。qRT-PCR显示该组血管生成相关基因CD31、Vcam1、VWF表达较H₂O₂组显著上调。管腔形成实验显示H₂O₂显著降低HUVEC成管能力，而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组管腔数量明显增加且结构清晰。划痕实验显示该组细胞迁移能力显著优于其他各组。

JC-1线粒体膜电位检测显示H₂O₂显著降低HUVEC线粒体膜电位（φM），而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组有效维持φM。转录组测序显示该组较H₂O₂组共鉴定2503个DEGs（1916个上调、587个下调）。KEGG通路分析显示NF-κB信号通路显著富集；Western blot证实H₂O₂显著抑制HIF-1α通路，而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE显著激活HIF-1α并恢复VEGF表达。

图5. SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶在ROS微环境中的促血管生成效应。 A）不同水凝胶孵育后HUVEC活力（n=3）；B）不同水凝胶处理后HUVEC血管生成相关基因（CD31、Vcam1、VWF）qRT-PCR检测（n=3）；C）不同水凝胶处理后HUVEC管腔形成光学图像，比例尺=100 μm；D、E）各组节点数与总长度定量（n=3）；F）不同水凝胶处理后HUVEC划痕实验图像，比例尺=100 μm；G）面积变化定量分析（n=3）；H）JC-1染色线粒体膜电位代表性图像及分析，红色示强膜电位，绿色示弱膜电位，比例尺=100 μm；I）H₂O₂组与水凝胶处理组差异表达基因火山图；J）差异表达基因统计图；K）差异表达基因通路富集因子图；L）H₂O₂及水凝胶处理后HUVEC中HIF-1α与VEGF表达Western blot分析；M）Western blot定量分析（n=3）。表示p<<0.01，表示p<<0.005，***表示p<<0.001。

（6）SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶在ROS失衡微环境中的抗炎能力

qRT-PCR显示SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组M2标志物（CD206、IL10、ARG-1）与M1标志物（IL1β、CD80、iNOS）均显著上调。流式细胞术显示H₂O₂显著增加CD86⁺ THP-1细胞比例、降低CD206⁺细胞比例，提示M1极化主导；而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE有效激活M2表型并 attenuate M1极化。ELISA显示该组抗炎细胞因子（TGFβ、bFGF、IL10）显著上调，促炎细胞因子（TNFα、IL-1β、IL6）显著下调。

转录组分析显示该组较H₂O₂组302个基因显著上调、85个显著下调。KEGG分析显示PI3K-AKT信号通路显著富集，与网络药理学预测一致。Western blot证实H₂O₂显著抑制巨噬细胞PI3K-AKT通路，而SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE显著激活该通路。

图6. SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶在ROS微环境中对巨噬细胞极化的影响。 A、B）不同水凝胶处理后PMA预处理的THP-1细胞中典型M2标志物（IL-10、ARG-1、CD206）和M1标志物（IL-1β、iNOS、CD80）的qRT-PCR分析（n=3）；C–F）流式细胞术检测不同水凝胶处理后PMA预处理THP-1细胞中M1标志物CD86和M2标志物CD163的群体分布（n=3）；G、H）ELISA检测不同水凝胶处理后THP-1细胞培养上清中细胞因子（TGF-β、IL10、bFGF、IL-1β、IL6、TNF-α）表达水平（n=3）；I）H₂O₂组与水凝胶处理组差异表达基因火山图；J）差异表达基因统计图；K）差异表达基因通路富集因子图；L）H₂O₂及水凝胶处理后巨噬细胞中AKT与p-AKT表达Western blot分析；M）Western blot定量分析（n=3）。表示p<<0.01，表示p<<0.005，***表示p<<0.001。

（7）SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶的体内创面愈合效应

糖尿病大鼠全层皮肤缺损感染模型中，SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组创面闭合显著优于Aquacel Ag商业敷料组及空白组。第12天时该组创面基本愈合，愈合率显著高于单药载组及空白组。H&E染色显示第7天该组肉芽组织显著增多；第12天各组均出现新生表皮，但该组表皮更厚、更自然成熟。Masson三色染色显示第18天该组胶原沉积量最高，结构致密、厚实且有序，毛囊丰富。

图7. 不同水凝胶处理感染性糖尿病创面的愈合评估。 A）不同水凝胶处理感染性糖尿病创面的治疗策略示意图；B）不同时间点感染性糖尿病创面代表性图像；C）第7天和第12天各组创面切片H&E染色，比例尺=1 mm；D）第18天各组创面Masson三色染色图像，比例尺=1 mm；E）治疗后创面愈合率定量（n=3）；F）第7天肉芽组织厚度统计（n=3）；G）第12天Masson三色染色胶原沉积统计（n=3）；H）第18天表皮厚度统计分析（n=3）。表示p<<0.05，**表示p<<0.005，****表示p<<0.001。

（8）SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶的体内抗菌、抗炎与血管化能力

第3天创面细菌计数显示，含AMP水凝胶组菌落形成显著低于其他组，SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE组抗菌效果最佳。第7天免疫荧光显示该组Ki-67显著上调、caspase-3显著下调，表明细胞增殖活跃、凋亡受抑；MPO⁺中性粒细胞与CD68⁺巨噬细胞浸润显著，提示免疫应答有效调控。

第7天抗炎因子IL4与TGFβ1表达显著上调，促炎因子IFN-γ与TNFα显著下调。血管化标志物CD31与VEGF表达显著增加。综上，SFMA/rColMA/LNP@AMP@PUE水凝胶通过消除细菌感染、刺激细胞活力、抑制炎症反应并增强新生血管形成，在创面微环境调控中发挥积极作用。

图8. 水凝胶体内抗菌能力与微环境调控评价。 A、C）第3天体内存活细菌克隆图像及统计（n=3）；B、D）第7天创面组织中Ki67、Caspase 3、MPO和CD68表达的免疫荧光染色及统计分析（n=3），比例尺=50 μm。表示p<<0.05，**表示p<<0.005，****表示p<<0.001。

图9. 水凝胶体内抗炎与血管化能力评价。 A、C）第7天不同处理后创面中IL4、TGFβ1、IFN-γ和TNF-α的免疫荧光图像及统计（n=3），比例尺=50 μm；B、D）第7天不同处理后创面中CD31和VEGF表达的免疫荧光图像及统计（n=3），比例尺=50 μm。表示p<<0.05，**表示p<<0.005，****表示p<<0.001。