针对上述问题，韩国科学技术院脑科学研究所Nakwon Choi、Ji Yoon Kang和高丽大学Ki Wan Bong合作，提出了一种基于介孔-大孔水凝胶的直接细胞外囊泡分离技术，无需预处理即可从多种生物体液（如全血、唾液、尿液、牛奶等）中高效分离细胞外囊泡，并支持升规模操作。该水凝胶具有约400纳米的孔径，通过表面电荷选择性捕获囊泡，并利用高离子强度实现高效回收，同时还可作为固相载体长期保存细胞外囊泡，便于后续分析。该文章于2025年9月24日以《Meso–macroporous hydrogel for direct litre-scale isolation of extracellular vesicles》为题发表于《Nature Nanotechnology》（DOI: 10.1038/s41565-025-02011-1）。

图1. 基于水凝胶的直接EV分离概述及介孔-大孔水凝胶颗粒的制备与孔径表征。a）从多种生物流体直接分离EV的示意图及其在诊断、预后、治疗和化妆品领域的应用，包括升级别分离及EV在水凝胶中的保存；b）冷冻光交联制备介孔-大孔PEG700DA颗粒的示意图；c）介孔-大孔（上）与微孔（下）颗粒在1小时内对多种荧光指示剂（~1 nm荧光素、4.72 nm FITC-葡聚糖、100 nm和200 nm绿色荧光二氧化硅纳米珠、450 nm FITC-二氧化硅纳米珠）一维径向扩散的荧光图像；d）11×11阵列介孔-大孔水凝胶颗粒照片（左）及冻干颗粒在玻璃瓶中的储存照片（右）。

（1）介孔-大孔水凝胶的制备与EV捕获原理

研究团队以700 Da分子量PEG二丙烯酸酯（PEG700DA）为前驱体，经-80 °C预冻10 min、365 nm紫外（2.5 mW·cm⁻²）曝光2 min的冷冻光交联制备介孔-大孔水凝胶颗粒，PDMS模具可实现121颗/批次的规模化生产（图1c,d）。荧光扩散实验证实该凝胶允许≤200 nm颗粒自由渗透而阻挡450 nm颗粒，未经预冻的微孔凝胶则连4.72 nm指示剂亦无法透过。EV分离采用"凝胶内捕获→洗涤→凝胶外回收"三步法，无需预处理及特殊设备（图2a），SEM/TEM/CLEM证实EV经1.5 M NaCl高盐环境选择性富集于凝胶内部，去盐后成功回收，产率较微孔凝胶提升约28倍（图2b）。其机制为PEG三维网链在高离子强度下通过空间屏蔽与Na⁺介导的静电排斥减弱，诱导EV表面电荷选择性聚集；而VLDL、LDL等胆固醇杂质因表面电荷差异几乎不被捕获（图2c）。Western blot证实CNX、APOB、APOA1、GOLGA2、CSN1S1等非EV杂质未检出或显著降低，冷冻电镜显示回收颗粒具典型脂质双层结构，负染TEM证实分离产物几乎无脂蛋白、病毒等污染物（图2d）。

图2.介孔-大孔水凝胶直接EV分离的流程与基本原理。a）EV分离流程示意图，包括一体式管分离（粉色虚线框）或可换管分离（绿色虚线框），标签1、2、3代表各步骤中样品依次转移至新管，SEM图像分别显示EV分离前（i）、凝胶内捕获后（ii）及凝胶外回收后（iii）的颗粒截面；b）介孔-大孔（蓝色）与微孔（灰色）水凝胶颗粒的EV产率及蛋白浓度（产率技术重复n=5，蛋白浓度n=3）；c）介孔-大孔水凝胶与盐（NaCl）介导的凝胶内主动捕获EV原理示意图，虚线框i–iii展示捕获机制的动态过程；d）介孔-大孔水凝胶分离EV的冷冻透射电镜图像，显示脂质双层结构。

（2）升规模EV分离与批次可重复性

通过按比例增加水凝胶颗粒数量，研究团队成功从1 L胃癌患者腹水及1 L牛乳中直接分离EV。五例晚期胃癌患者腹水EV均显示典型EV尺寸分布、产率及纯度，且均表达EV阳性标志物CD63、PDCD6IP（ALIX）及肿瘤转移标志物N-cadherin（CDH2）、claudin-1（CLDN1）、angiogenin（ANG）（图3a,b）。1 L牛乳EV分离量较1 mL提升三个数量级，且尺寸分布、产率及纯度与1 mL批次无显著差异（图3c–e），表明该方法在升级别仍保持一致性。此外，水凝胶颗粒经RIPA处理后重复使用，EV产率与新鲜颗粒无统计学差异，展现出良好的可持续性与成本效益。

图3.介孔-大孔水凝胶颗粒的升级别直接EV分离。a）五例胃癌患者腹水EV的尺寸分布、产率及纯度（技术重复n=5，生物学重复n=5）；b）Western blot显示腹水EV中EV阳性标志物（CD63、PDCD6IP）及肿瘤转移标志物（CDH2、CLDN1、ANG）的表达（每泳道上样总蛋白70 μg）；c）玻璃瓶中冻干水凝胶颗粒（左）及倒入1 L牛乳后的照片（右）；d）1 L（紫色）与1 mL（蓝色）牛乳EV分离量（技术重复n=3）；e）1 L与1 mL牛乳EV的尺寸分布、产率及纯度（产率P=0.1119，纯度P=0.3422，无显著差异）。

（3）水凝胶作为EV固相保存载体

与常规大孔水凝胶脱水后机械强度不可逆丧失不同，介孔-大孔水凝胶经冻干-再水化循环后仍保持结构完整性（图4a）。加速老化实验（94 °C、3天，等效24 °C储存1年）及冻干再水化后，血浆EV产率与新鲜湿态颗粒无显著差异（P=0.8578），证实其卓越的长期稳定性（图4b）。

将EV捕获并洗涤后的水凝胶颗粒冻干，室温储存数天后回收，EV的尺寸分布、产率及纯度与立即回收组无显著差异（P=0.4445）；室温储存60天内，产率在32天内保持相对稳定，至第60天仅下降约20%，显著优于文献报道的-20 °C储存8周产率下降约80%及-80 °C下降约40%的结果（图4c–e）。该特性使水凝胶成为无需冷链的EV固相保存载体，极大拓展了EV的时空应用范围。

图4.介孔-大孔水凝胶作为EV保存载体。a）水凝胶颗粒湿态（左）、冻干脱水态（中）及再水化态（右）的照片，白色虚线圆圈指示冻干前湿态颗粒尺寸；b）加速老化1年等效（红色）、冻干再水化（黄色）及湿态（蓝色）颗粒分离EV的产率（P=0.8578，无显著差异）；c）从冻干EV捕获水凝胶颗粒室温储存后分离EV的流程示意图；d）立即回收（对照，蓝色）与冻干EV捕获水凝胶颗粒室温储存5天后回收（红色）的EV尺寸分布及纯度（P=0.4445）；e）冻干后不同储存时间EV的相对产率（以第0天产率为基准，技术重复n=3）。

（4）可定制性与多生物流体适用性

通过调节凝胶外回收体积，可在保持相同EV总量的前提下实现按需富集（图5a）。制备更小体积（10 μL/颗）的水凝胶颗粒，可将回收体积降至10 μL而不损失EV，且将分离时间从80 min缩短至15 min（图5b,c）。通过调控冷冻温度（-80 °C vs -195 °C液氮），可调节冰晶尺寸进而调控孔径，实现较小EV亚群的选择性分离，产率略降但纯度保持（图5d,e）。

该方法适用于全血、血浆、腹水、唾液、尿液、牛乳及干细胞培养基等多种生物流体。尤其值得注意的是，传统方法需经连续离心和过滤去除红细胞、白细胞及血小板后才能从全血中分离EV，而本方法可直接处理全血，人全血EV产率约为超速离心的2倍，纯度相当（图5f,g）；小鼠全血中产率高3倍、纯度高1.2倍。对于唾液和hESC培养基等EV浓度低、黏度高的样本，该方法同样展现出与超速离心相当或更优的产率与纯度，且可获得更高比例的小EV（30–200 nm）。

图5.水凝胶基EV分离的可定制性与多用途性。a）不同凝胶外回收体积下的EV产率（蓝色）与总量（灰色）（与200 μL相比，40 μL和400 μL产率P=0.0002和P<0.0001，总量无显著差异）；b）10 μL颗粒在不同回收体积下的EV总量（P=0.1779）；c）15 min与80 min分离时间的EV尺寸分布、产率及纯度（产率P=0.0894，纯度P=0.0403）；d）不同冷冻温度（-80 °C vs -195 °C）下制备水凝胶分离EV的粒径（P=0.0011）；e）不同冷冻温度下EV的尺寸分布、产率（P=0.0204）及纯度（P=0.8866）；f）人全血EV分离流程对比示意图（水凝胶法80 min vs 超速离心185 min）；g）水凝胶（蓝色）与超速离心（灰色）分离全血EV的尺寸分布、产率（P=0.0035）及纯度（P=0.7986）。

（5）下游治疗与诊断应用

在治疗与化妆品领域，牛乳EV因其治疗潜力备受关注，但传统超速离心需7步连续离心/过滤、耗时超6 h。水凝胶法不仅省去繁琐预处理，分离时间缩短约5.6倍，且产率和纯度显著优于超速离心，同体积牛乳可获得1539倍更多的纳米颗粒（图6a,b）。等体积分析（1 mL分离产物处理50 mL来源乳）显示，水凝胶分离的牛乳EV使人真皮成纤维细胞（hDFs）增殖提升22%（较超速离心）和50%（较对照）；等蛋白量分析中，两组对hDFs增殖及II型胶原表达的促进作用相当。人角质形成细胞（HaCaT）实验证实，水凝胶分离的牛乳EV可促进细胞增殖并提升谷胱甘肽化蛋白表达，与超速离心组效果相似，且该效应确源于EV本身而非残留蛋白（图6c–g）。

在诊断领域，研究团队从人尿液中直接分离EV，通过水凝胶基杂交链式反应（HCR）检测EV miRNA（miR-6090/miR-3665），成功实现前列腺癌患者与健康对照的显著区分（P<0.0001）（图6h,i），验证了该方法在临床诊断中的实用性。

图6.治疗与诊断的下游分析。a）牛乳EV分离流程对比示意图（水凝胶法80 min vs 超速离心450 min）；b）水凝胶（蓝色）与超速离心（灰色）分离牛乳EV的尺寸分布、产率及纯度（P<0.0001）；c）等体积分析中hDFs增殖率（DIV 3，水凝胶较超速离心P=0.0110，较对照P=0.0348）；d）等颗粒数分析中hDFs增殖率；e）等颗粒数分析中hDFs核（蓝色）与II型胶原（绿色）免疫荧光图像；f）等颗粒数分析中HaCaT细胞增殖率；g）等颗粒数分析中HaCaT细胞谷胱甘肽化蛋白及GAPDH的Western blot；h）水凝胶与超速离心分离人尿EV的尺寸分布及纯度（P=0.7522）；i）尿EV miRNA诊断分析流程示意图及12例健康对照与12例前列腺癌患者的比率荧光信号（miR-6090/miR-3665，P<0.0001）。