针对上述问题，山东大学齐鲁口腔医院葛少华、马保金、于洋团队提出了一种简便且普适性强的保护性递送策略。利用表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与神经调节蛋白-1（NRG-1）间的多重物理相互作用，自组装形成NE APs颗粒。该颗粒可实现NRG-1的持续释放并保护其免受氧化损伤，完整保留其促进细胞招募、迁移及血管生成的生物学功能；同时EGCG可清除活性氧、维持线粒体稳态，并协同调控TNF/NF-κB/JAK-STAT信号通路以调节免疫反应和促进成骨分化。这种基于多酚-生长因子自组装的多功能递送策略为提升再生医学中生长因子的治疗效率提供了新途径。该文章于2025年3月18日以《A protective growth factor delivery strategy based on polyphenol-protein self-assembly to promote inflammatory bone regeneration》为题发表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2025.123272）。

研究示意图

（1）NE APs的合成与表征

NE APs通过一步自组装反应合成：将20 mg/mL EGCG与100 μg/mL NRG-1等体积混合，剧烈震荡1 min后12,000 rpm离心5 min，形成白色沉淀。以BSA替代NRG-1预实验优化比例，确定BSA与EGCG重量比5（μg/mg）为最优参数。SEM/TEM显示NE APs呈纳米颗粒聚集体（图1B），EDS元素mapping证实C、O、N均匀分布（原子百分比约50.6%、31.2%、16.7%、1.4%）（图1C），DLS测得平均水动力学直径2–4 μm（PDI=0.413）（图1D）。FT-IR显示EGCG酚环C–OH弯曲振动峰（622、721 cm⁻¹）及羰基峰（1690 cm⁻¹）消失，1,611 cm⁻¹峰展宽归因于蛋白质羧基伸缩，1,450–1,510 cm⁻¹芳香C–C伸缩峰保留，表明EGCG骨架完整（图1E）。XPS显示C1s、O1s、N1s特征峰证实组装未改变原子价态（图1F）。分子动力学模拟显示EGCG与NRG-1结合自由能−6.01 kcal/mol，由氢键、库仑力及疏水作用驱动，保护NRG-1免受ROS损伤并促进控释（图1G）。释放曲线显示3 h突释后336 h趋于稳定（图1H），且NE APs对DPPH、·OH、·O₂⁻清除能力随浓度显著增加（图1I）。

图1. NE APs的制备与表征。（A）EGCG与NRG-1混合后剧烈震荡自组装成颗粒的光学图像；（B）NE APs的SEM和TEM图像；（C）NE APs的EDS元素mapping图；（D）NE APs的水动力学直径分布；（E）EGCG/BSA、EGCG和BSA的FT-IR光谱；（F）NE APs的XPS光谱；（G）NE APs中EGCG与NRG-1结合界面相互作用的3D相互作用图及表面结构图；（H）NE APs中NRG-1随时间的累积释放曲线；（I）不同浓度NE APs对三种典型自由基（DPPH、·OH和·O₂⁻）的清除活性。

（2）NE APs保护NRG-1免受氧化应激损伤

CCK-8实验显示NE APs在0–40 μg/mL范围内对PDLSCs无显著毒性，10 μg/mL被选为后续实验浓度；活/死及细胞骨架染色证实其优异生物相容性（图S6–S8）。Transwell实验显示NE APs招募PDLSCs数量多于对照组和EGCG组，略低于NRG-1组，归因于NRG-1缓释效应；划痕实验显示NE APs组24 h愈合率38.7%，低于NRG-1组（65.6%），但显著高于EGCG（13.7%）和对照组（6.6%）（图2C、D）。H₂O₂处理后NRG-1招募能力显著下降，而NE APs在氧化应激下仍维持较强招募能力。HUVECs管腔形成实验显示NE APs和NRG-1组形成最高密度管状网络，节点数、网格数、片段数和总管长分别为对照组1.37、1.9、1.53和1.21倍（图2E、F）；H₂O₂使NRG-1几乎完全丧失促血管能力，而H₂O₂/NE APs组仍保留该能力，且CD31、KDR和VEGF表达显著上调。综上，NE APs有效保护NRG-1免受氧化损伤，保留其细胞招募、迁移及促血管生成活性。

图2. NE APs保护NRG-1免受H₂O₂诱导的损伤。（A）Transwell细胞迁移实验评估PDLSCs在各组（阴性对照NC、NRG-1、EGCG、NE APs、H₂O₂/NRG-1和H₂O₂/NE APs）中的趋化行为代表性图像；（B）迁移细胞计数及数据分析；（C）PDLSCs二维划痕实验代表性图像；（D）划痕愈合率的定量分析；（E）各组HUVECs 12 h管腔形成图像；（F）节点数的半定量分析（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，与对照组相比）。

（3）NE APs的细胞内抗氧化与线粒体保护作用

DCFH-DA检测显示，H₂O₂诱导后NRG-1组荧光强度与H₂O₂组无差异，而EGCG或NE APs显著降低荧光强度；流式细胞术证实EGCG和NE APs处理后平均荧光强度分别降至~24.8%和~11.8%，即消除~44.8%和~73.3%的ROS（图3A、B）。RT-qPCR显示H₂O₂下调CAT和SOD1表达，而NE APs和EGCG显著上调二者表达，恢复氧化还原平衡（图3C）。JC-1检测显示健康PDLSCs A/M比值8.70，H₂O₂刺激后骤降至1.74，NE APs和EGCG分别上调至6.49和5.60，显著高于NRG-1组1.69（图3D）；Mito-Sox Red染色显示NE APs和EGCG分别使线粒体ROS降低6.83和4.99倍（图3E）。TEM显示H₂O₂组线粒体受损、嵴碎片化，NE APs显著减少损伤并恢复线粒体形态（图3F）。综上，NE APs兼具生长因子保护与强效抗氧化能力，可有效清除ROS并维持线粒体功能。

图3. NE APs的细胞内ROS清除活性。（A）流式细胞术检测ROS染色后的荧光强度；（B）ROS阳性率的定量统计分析；（C）H₂O₂刺激下不同处理后抗氧化酶（CAT和SOD1）的相对mRNA表达水平；（D）JC-1染色监测PDLSCs线粒体膜电位；（E）不同处理下线粒体ROS的Mito-Sox染色代表性荧光图像；（F）不同处理后PDLSCs线粒体形态和分布的TEM代表性图像（***P < 0.001，与H₂O₂组相比）。

（4）NE APs调控炎症反应与巨噬细胞极化

LPS诱导的RAW264.7细胞中，免疫荧光和流式显示LPS组iNOS表达最高，NRG-1和EGCG组显著降低，NE APs组iNOS表达甚至低于后两者，归因于EGCG与NRG-1协同效应；流式结果示NE APs组iNOS阳性巨噬细胞比例由80.7%降至53.5%（图4A、B），RT-qPCR证实其下调iNOS及IL-6、TNF-α、CCL-2表达（图4C、D）。M2极化方面，NRG-1组与对照组无差异，而EGCG和NE APs显著上调CD206表达，流式证实NE APs组CD206阳性比例最高（图4E–G），RT-qPCR显示其上调CD206和IL-10（图4H、I）。此外，LPS诱导的PDLSCs中，NE APs显著下调IL-8和IL-6表达，ELISA证实二者浓度显著低于其他各组（图4J、K）。综上，NE APs显著增强RAW264.7和PDLSCs抗炎能力，调控炎症反应并促进骨组织再生。

图4. NE APs的抗炎效应。（A）RAW264.7细胞iNOS免疫荧光染色；（B）流式细胞术检测iNOS阳性RAW264.7细胞比例；（C）iNOS相对mRNA表达水平；（D）促炎细胞因子相对mRNA表达水平；（E）RAW264.7细胞CD206免疫荧光染色；（F）流式细胞术检测CD206阳性细胞比例；（G）CD206阳性RAW264.7细胞比例的定量分析；（H）CD206相对mRNA表达水平；（I）抗炎细胞因子IL-10相对mRNA表达水平；（J）LPS刺激下不同处理后PDLSCs炎症反应的RT-qPCR检测；（K）LPS刺激下不同处理后PDLSCs炎症反应的ELISA检测（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，图C、D、J、K与LPS组相比；图G、H、I与对照组相比）。

（5）转录组测序揭示NE APs的抗炎机制

全转录组测序显示三组实验结果高度一致（图5A），共鉴定4,195个DEGs（2,009个上调、2,186个下调，FDR < 0.05且FC ≥ 2），表明NE APs与LPS组存在显著转录组差异（图5B）；热图显示NE APs上调抗炎基因Stc1和Hsd11b2、下调促炎基因F5（图5C）。GO分析显示DEGs显著富集于炎症反应、IL-17正向调控、IL-2负向调控及细胞对IL-1响应等过程，且均呈下调趋势（图5D）；KEGG分析突出TNF/NF-κB/JAK-STAT轴参与（图5E），GSEA进一步证实DEGs富集于TNF、NF-κB和JAK-STAT通路（图5F–H）。Western blot显示NE APs显著下调p-p65和p-IκBα表达（图5I、J），有效抑制NF-κB通路，同时通过调控IL-17和MAPK通路抑制炎症。综上，NE APs有效降低LPS诱导的炎症反应，为炎性骨组织修复提供治疗潜力。

图5. 转录组测序分析。（A）样本间距离热图；（B）对照组与NE APs组差异基因的火山图；（C）对照组与NE APs组差异基因热图；（D）NE APs处理后PDLSCs差异基因的GO分析；（E）KEGG富集分析气泡图；（F–H）基于GSEA的TNF、NF-κB和IL-17信号通路分析；（I）p-p65和p65的Western blot及定量分析；（J）p-IκBα和IκBα的Western blot及定量分析（P < 0.01，*P < 0.001，与对照组相比）。

（6）NE APs促进PDLSCs体外成骨分化

ALP染色显示NE APs和EGCG组在7 d和14 d均呈强阳性，显著强于NRG-1和对照组，表明EGCG促进PDLSCs早期成骨分化且NE APs进一步增强该效应（图6A）；RT-qPCR显示NRG-1组成骨基因表达与对照组相当，EGCG组显著上调ALP、BMP2和OPN，NE APs组上调幅度更大（图6B）。ARS染色显示21 d和28 d各组钙结节增加，NE APs组染色最丰富、数量最多（图6C、D），证实其具有优越的体外骨诱导活性。该多酚-生长因子自组装策略既保留EGCG成骨潜力，又通过缓释增强其成骨活性。

图6. NE APs对PDLSCs的成骨效应。（A）各组PDLSCs 7 d和14 d ALP染色；（B）各组PDLSCs 7 d和14 d成骨分化相关基因ALP、BMP2和OPN表达；（C）各组PDLSCs 21 d和28 d成骨矿化相关ARS染色；（D）相对ARS水平的半定量分析（***P < 0.001，与对照组相比）。

（7）NE APs在小鼠牙周炎模型中的体内治疗效果

通过LPS局部注射和丝线结扎建立小鼠牙周炎炎性骨缺损模型，Micro-CT显示Perio组CEJ-ABC增至345 μm，证实模型成功；NRG-1和EGCG部分抑制骨吸收，而NE APs组效果最显著，治疗4周后CEJ-ABC降至90.5 μm，接近正常组75.7 μm（图7A、D），且BV/TV、BS/TV最高而Tb.Sp最低，4周后几乎达正常水平（图7B）。H&E显示NE APs组2周即形成大量新骨，4周缺损几乎全填充，Masson染色示上皮层厚、胶原致密（图7C、E）；COL I免疫组化显示其新生组织COL I含量最高（图7F）。免疫组化显示NE APs组M1巨噬细胞（CD80）显著减少，M2（CD206）4周接近正常水平（图8A–C）；双免疫荧光示NE APs组CD44⁺PDLSCs招募显著强于NRG-1组，α-SMA表达最高（图8D–F），证实其调控免疫微环境、招募干细胞并促进血管生成。主要器官H&E及血常规显示NE APs生物安全性良好。

图7. NE APs在小鼠牙周炎模型中的治疗效果。（A）治疗后2周和4周上颌牙槽骨Micro-CT三维重建图像；（B）BV/TV、Tb.Sp和BS/TV的定量Micro-CT分析；（C）治疗后2周和4周H&E染色图像；（D）H&E染色评估的CEJ-ABC距离定量分析；（E）治疗后2周和4周上颌牙槽骨缺损Masson染色图像；（F）治疗后2周COL I染色图像（P < 0.01，*P < 0.001，与对照组相比）。

图8. NE APs在体内的免疫调节、干细胞招募和血管生成。（A）治疗后2周和4周上颌牙槽骨缺损M1巨噬细胞标记CD80和M2巨噬细胞标记CD206的免疫组化分析；（B）各组CD80⁺细胞定量分析；（C）各组CD206⁺细胞定量分析；（D）免疫荧光染色可视化骨缺损区域内PDLSCs的存在和分布；（E）治疗后2周和4周骨缺损区域内血管生成相关标记α-SMA的免疫荧光染色；（F）各组α-SMA表达的定量分析（P < 0.01，*P < 0.001，与对照组相比）。