针对上述问题，澳门大学王瑞兵团队联合深圳大学高成团队合作设计并构建了一种经应力训练的雨生红球藻（HP）基杂交微型机器人EcN@PDA@HP，实现虾青素（AST）与益生菌EcN的口服协同递送用于IBD治疗。通过氮饥饿、持续光照和温和酸性应力预处理HP，使其生物合成AST并增厚细胞壁，获得优异的胃酸耐受性和自驱动运动能力；同时用聚多巴胺（PDA）包被EcN增强肠道黏附性，并通过β-环糊精-金刚烷主客体作用将两者组装成杂交机器人。HP的快速胃通过与耐酸保护使机器人完整抵达肠道，PDA"智能刹车"系统使其选择性滞留于炎症部位，实现AST持续释放与EcN高效定殖。在DSS和沙门氏菌诱导的结肠炎小鼠模型中，EcN@PDA@HP显著抑制疾病进展，包括巨噬细胞重编程、减少上皮凋亡、修复肠道屏障、降低炎症因子、清除ROS及重塑肠道菌群。该工作首次构建了兼具生物合成抗氧化剂与智能运动能力的益生菌负载微藻机器人，为IBD口服组合治疗提供了新策略。该文章于2026年1月6日以《Stress-trained microalgae robots with probiotics backpack and intestinal brake for inflammatory bowel disease management》为题发表于《Nature Communications》上（DOI:10.1038/s41467-025-66692-x）。

图1. EcN@PDA@HP微型机器人的构建及其治疗IBD的机制。（A）EcN@PDA@HP机器人的制备过程示意图。（B）治疗IBD机制。

（1）EcN@PDA@HP 机器人的制备与表征

PDA通过共价键或氢键原位聚合于EcN表面，形成EcN@PDA。TEM和SEM显示EcN呈典型杆状且边缘清晰，PDA包覆后表面粗糙（图2A、B），水合粒径从1560 nm增至1893 nm，zeta电位从-30.26 mV变为-26 mV（图2C、D）。ADA通过ADA-PEG-NHS与EcN@PDA表面伯胺反应进行功能化，经Cy5标记的β-CD验证，细菌表面呈现红色荧光且24 h内稳定（图2E）。经氮饥饿、连续光照和弱酸预处理6天的HP通过β-CD-PEG-NHS修饰，FITC标记的ADA验证显示HP表面呈现绿色荧光并维持24 h（图2F）。

通过主客体相互作用，ADA修饰的EcN@PDA与β-CD修饰的HP结合形成EcN@PDA@HP。SEM确认EcN@PDA附着于HP表面（图2G），未修饰组分无显著结合，结合物至少稳定24 h。GFP标记的EcN@PDA与HP孵育2 h后，HP表面出现绿色荧光，流式细胞术显示结合效率约75.3%（图2H-J）。在SGF（pH 3.5）中孵育2 h后结合率约59%，SIF（pH 6.8）中24 h结合率为65.8%。HP在SGF中2 h后存活率为57.2%，SIF中24 h存活率为65.7%。平板计数显示单个HP表面可携带超过300个EcN细胞（图2K、L）。

EcN@PDA@HP的OD600值与未处理EcN及EcN@PDA相似，表明修饰未影响细菌活力（图3A）。在含胃蛋白酶的SGF（pH 3.5）中，EcN@PDA和EcN@PDA@HP在0.5、1、2 h时的存活率显著高于裸EcN（图3B）；在含胰蛋白酶的SIF（pH 6.8）中，EcN@PDA和EcN@PDA@HP的存活率与未处理EcN相当（图3C），表明PDA涂层可保护EcN抵抗胃酸，且不影响其在肠道环境中的存活。

图2. Haematococcus pluvialis–EcN杂交微型机器人（EcN@PDA@HP）的制备与表征。（A、B）EcN（A）和EcN@PDA（B）的典型TEM图像。（C）EcN和EcN@PDA的zeta电位。（D）EcN和EcN@PDA的粒径分布。（E）GFP标记的EcN经ADA-PEG-NHS修饰后与CD-Cy5孵育5 min的荧光图像，未修饰ADA的EcN@PDA作为对照。（F）HP经β-CD-PEG-NHS修饰后与ADA-FITC孵育5 min的荧光图像，未修饰β-CD的HP作为对照。（G）不同配方EcN@PDA与HP的伪彩SEM图像。（H）不同配方EcN@PDA与HP的荧光图像，Cy5通道显示天然藻类叶绿体自发荧光，GFP通道显示荧光EcN。（I、J）不同组HP携带GFP标记EcN的比例。（K、L）不同组HP表面附着EcN的数量。

（2）EcN@PDA@HP 机器人的运动行为和 ROS 清除

始HP（OHP）在SGF中孵育2 h后活性显著下降，难以维持自运动能力；而预训练HP和EcN@PDA@HP表现出更好的SGF耐受性和固有运动性。运动轨迹显示，EcN@PDA@HP和HP在SGF中孵育不同时间后均保持良好的运动性，而OHP组运动性迅速下降，30 min后尤为明显，运动距离显著缩短（图3D-F）。预训练HP的平均速度（79.35 μm/s）略低于游离OHP（94.78 μm/ s），但在SGF中孵育120 min后仍保持高速水平（61.91 μm/s1），与EcN@PDA@HP（60.70 μm/s1）相当（图3K）。在SIF中，OHP、预训练HP和EcN@PDA@HP均维持长时间运动能力（图3G-I）。EcN@PDA@HP在SGF中预孵育2 h后（EcN@PDA@HP (SGF)）在SIF中仍表现出强劲的运动性（图3J、L），这可能归因于预训练条件下增厚的HP细胞壁使其能够克服胃酸屏障。

HP在恶劣环境下产生抗氧化虾青素（AST）以减轻氧化应激和炎症。利用纤维素酶和果胶酶裂解HP细胞壁获得原生质体以释放生物合成AST，用于体外抗氧化活性评价。EcN@PDA@HP对H2O2、·O2−和·OH表现出最强的ROS清除能力，优于维生素C和化学合成AST（图3M-O）。CCK-8实验显示AST、HP和EcN@PDA@HP在24 h孵育后无细胞毒性，流式细胞术分析显示各处理组对NCM460细胞凋亡影响可忽略，表明其良好的体外生物相容性。在transwell模型中，预训练HP或EcN@PDA@HP的加入显著降低了H₂O₂处理NCM460细胞内的·O₂−（图3Q、R）和H₂O₂（图3S、T）浓度。EcN@PDA@HP在SGF中保持优异的运动性，并能在酶解作用下释放生物合成AST以有效清除ROS。

图3. EcN@PDA@HP机器人的环境耐受性、运动性及体外抗氧化评价。（A）EcN、EcN@PDA、EcN@PDA@HP在37 °C的LB培养基中的生长曲线。（B）暴露于SGF（pH = 3.5）后EcN、EcN@PDA和EcN@PDA@HP的存活率。（C）暴露于SIF（pH = 6.8）后EcN、EcN@PDA和EcN@PDA@HP的存活率。OHP（D）、HP（E）和EcN@PDA@HP（F）在SGF（pH = 3.5）中孵育不同时间（0、15、30、60和120 min）后的10 s运动轨迹。OHP（G）、HP（H）和EcN@PDA@HP（I）在SIF（pH = 6.8）中孵育不同时间（0、2、4和8 h）后的10 s运动轨迹。（J）EcN@PDA@HP（SGF）为将EcN@PDA@HP在SGF中孵育2 h所得，记录其在SIF（pH = 6.8）中孵育不同时间（0、2、4和8 h）后的10 s运动轨迹。（K）OHP、HP和EcN@PDA@HP在SGF（pH = 3.5）中孵育不同时间（0、15、30、60和120 min）后的平均速度。（L）OHP、HP、EcN@PDA@HP和EcN@PDA@HP（SGF）在SIF（pH = 6.8）中孵育不同时间（0、2、4和8 h）后的平均速度。（M）H2O2、（N）·O2−和（O）·OH的清除性能。（P）EcN@PDA@HP通过transwell模型清除NCM 460细胞中ROS的示意图。（Q、R）不同处理后细胞·O2−水平的流式细胞术分析。（S、T）不同处理后细胞H2O2水平的流式细胞术分析。

（3）评估 EcN@PDA@HP 的粘膜粘附（“制动”）能力

口服给药1 h后，OHP荧光主要集中于胃部，肠道荧光不明显，表明其活性降低，失去快速通过胃部的运动特性；而预训练HP和EcN@PDA@HP因适应胃酸环境且具有自身运动性，快速避开胃酸侵蚀并蓄积于肠道（图4A、B）。将HP、EcN@PDA与HP物理混合（EcN@PDA + HP）及EcN@PDA@HP与小鼠离体肠道在PBS中孵育1 h后，EcN@PDA@HP处理组肠道荧光强度显著高于HP和EcN@PDA + HP处理组，表明PDA层可增强HP微藻机器人在肠道中的黏附（图4C、D）。体内实验显示，EcN@PDA@HP处理组小鼠荧光滞留时间显著长于HP和EcN@PDA + HP处理组，口服24 h后荧光仍很强，归因于EcN@PDA在炎症肠道中的优异黏附能力（图4E、F）。结肠组织中AST水平定量分析显示，EcN@PDA@HP处理组AST水平最高。生物扫描电镜显示EcN@PDA@HP在结肠中表现出强滞留性和完整的EcN定植，而HP或EcN@PDA + HP物理混合组几乎无滞留。其他器官荧光可忽略，表明口服EcN@PDA@HP具有良好的安全性。实验终点收集小鼠整个胃肠道，Cy5通道显示HP荧光，FITC通道显示GFP标记的EcN。HP和EcN@PDA + HP处理组小鼠整个胃肠道中仅残留少量HP；而EcN@PDA@HP处理组肠道HP荧光强度高，且绿色荧光EcN与红色荧光HP（Cy5）基本重叠，表明EcN@PDA@HP结构稳定性持久，可实现手拉手递送（图4G、H）。HP与EcN@PDA物理混合处理组中红色（HP）与绿色（EcN）荧光重叠区域可忽略。EcN@PDA@HP通过HP的运动性快速通过胃部，并借助PDA涂层的制动系统效应在炎症肠道中有效蓄积。

图4. EcN@PDA@HP体内通过胃部及肠道黏附（"制动"）能力的评价。（A）口服给药1 h后整个胃肠道的荧光图像。（B）口服给药1 h后各组小鼠胃和肠道荧光强度的定量分析。（C）离体肠道与HP、EcN@PDA + HP和EcN@PDA@HP分别孵育后的荧光图像。（D）离体肠道与HP、EcN@PDA + HP和EcN@PDA@HP分别孵育后荧光强度的定量分析。（E）不同时间点各组处理小鼠的荧光图像。（F）不同时间点处理小鼠体内荧光强度的定量分析。（G、H）口服给药24 h后整个胃肠道的荧光图像。Cy5通道：HP；FITC通道：GFP标记的EcN

（4）EcN@PDA@HP 能有效治疗 DSS 诱导的急性结肠炎

在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，EcN@PDA@HP显著抑制体重下降（图5B）并降低疾病活动指数（图5C），优于EcN@PDA、HP和EcN@PDA + HP处理组。EcN@PDA@HP处理组小鼠未出现明显便血，结肠长度显著长于其他各组（图5D、E）。H&E染色显示，EcN@PDA@HP处理组黏膜结构完整，隐窝结构有序，炎症细胞浸润显著减轻，杯状细胞恢复（图5F）。免疫荧光染色显示，EcN@PDA@HP处理组结肠中CD86+ M1型巨噬细胞显著减少，流式细胞术证实其显著增加M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD206+）比例约4倍，同时降低M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD86+）比例（图5G），表明其促进巨噬细胞从M1向M2表型极化。

EcN@PDA@HP处理组结肠组织MDA水平显著降低，SOD活性显著增强（图5H、I）。DHE荧光探针检测显示，EcN@PDA@HP处理组红色荧光强度显著减弱，表明其具有强效ROS清除能力（图5J）。免疫荧光共染色显示，该抗氧化效应通过激活Nrf2/HO-1信号轴介导，EcN@PDA@HP处理显著上调Nrf2核转位和HO-1表达。EcN@PDA@HP处理显著降低局部促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平（图5K-M），并有效恢复紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，恢复上皮屏障完整性（图5N）。

16S rRNA基因扩增子测序分析显示，NMDS图揭示DSS诱导的结肠炎小鼠与健康对照组微生物谱明显分离，而EcN@PDA@HP处理组肠道微生物谱与正常健康小鼠相似（图6A）。层次聚类树显示EcN@PDA@HP在ASV水平上与健康小鼠组最接近（图6B）。微生物失调指数（MDI）定量显示，EcN@PDA@HP干预在所有治疗组中实现最显著的MDI降低（图6C）。门水平分类学分析显示，EcN@PDA@HP处理组与健康组组成相似，Bacteroidota相对丰度增加（图6D、E），Proteobacteria扩增被有效抑制（图6F）。属水平热图分析显示，EcN@PDA@HP处理显著增加norank_f_Muribaculaceae相对丰度（图6H），并显著降低Escherichia-Shigella和Enterococcus定植（图6I、J）。

图5. EcN@PDA@HP在急性结肠炎中治疗效果的验证。（A）DSS诱导急性结肠炎小鼠的治疗方案示意图。（B）六组小鼠体重变化曲线，以第0天体重的百分比进行归一化。（C）治疗小鼠DAI评分的曲线分析。（D）口服不同制剂后小鼠结肠的照片。（E）治疗小鼠结肠长度的柱状图分析。（F）H&E染色切片的组织学图像（黑色箭头：完整的隐窝结构，黄色箭头：黏膜上皮细胞脱落，蓝色箭头：炎症细胞浸润，红色箭头：隐窝和杯状细胞丢失）。（G）治疗小鼠结肠的CD86（M1型巨噬细胞）和CD206（M2型巨噬细胞）染色。（H、I）治疗小鼠血清中MDA水平和SOD活性。（J）治疗小鼠结肠的DHE染色。（K–M）不同组结肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。（N）Occludin和ZO-1染色结肠组织的免疫荧光图像。

图6. EcN@PDA@HP恢复DSS诱导急性结肠炎小鼠的肠道菌群稳态。（A）NMDS评分图展示肠道微生物组β多样性。（B）各组间ASV水平的层次聚类树。（C）不同制剂间的微生物失调指数。（D）各组在门水平上分类群相对丰度的热图，以相对百分比表示。（E、F）拟杆菌门和变形菌门的相对丰度。（G）各组间属水平丰度的柱状图。（H-J）不同给药后norank_f_Muribaculaceae、Escherichia-Shigella和Enterococcus的属水平丰度。

（5）EcN@PDA@HP治疗DSS诱导的慢性结肠炎的疗效

在DSS诱导的慢性结肠炎模型中，EcN@PDA@HP显著改善体重下降（图7B）并降低DAI评分（图7E）。Model、EcN@PDA、HP和EcN@PDA + HP组小鼠出现不同程度的便血，而EcN@PDA@HP处理组在研究终点无明显便血（图7C）。EcN@PDA@HP处理组结肠长度长于其他各组，抑制了慢性结肠炎模型中典型的结肠缩短（图7D、G）。H&E染色显示，EcN@PDA@HP干预保留了隐窝-绒毛结构完整性，减轻炎症细胞募集，促进杯状细胞再生，恢复黏膜稳态（图7F）。EcN@PDA@HP组MDA水平显著降低，SOD水平显著升高，表明慢性炎症结肠中氧化损伤减轻（图7H、I）。TUNEL染色显示，EcN@PDA@HP处理组TUNEL荧光强度（绿色）显著减弱，表明结肠炎相关结肠区域凋亡明显减少（图7M、N）。结肠炎症介质定量分析显示，EcN@PDA@HP处理组促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β显著下调（图7J-L）。肠道屏障组分的免疫荧光评估显示，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达和分布模式显著上调（图7O-Q）。

图7. EcN@PDA@HP治疗慢性结肠炎的疗效。（A）DSS诱导慢性结肠炎小鼠的治疗方案示意图。（B）六组小鼠体重随时间的变化曲线，以第0天体重的百分比进行归一化。（C）不同组小鼠肛门腹泻和便血的代表性照片。（D）治疗小鼠结肠的照片。（E）治疗小鼠DAI评分的曲线分析。（F）H&E染色切片的组织学图像（黑色箭头：完整的隐窝结构，黄色箭头：黏膜上皮细胞脱落，蓝色箭头：炎症细胞浸润，红色箭头：隐窝和杯状细胞丢失）。（G）不同制剂间结肠长度的柱状图分析。（H、I）血清中MDA水平和SOD活性。（J–L）不同组结肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。（M、N）结肠组织中Apo-BrdU表达的荧光照片及Tunel的定量分析。（O–Q）结肠组织中Occludin和ZO-1的免疫荧光图像及定量分析。