研究背景：

针对上述问题，浙江大学周民、路静团队提出一种口服水凝胶递送策略（SP@Rh-gel），用于共载螺旋藻（Spirulina platensis）与蒽醌（rhein），通过调控微生物‑肠‑脑轴以治疗炎症性肠病（IBD）及其伴随的焦虑与抑郁。该水凝胶系统显著提升了药物的溶解性、释放性能及肠道滞留能力，从而增强了口服治疗的效果。研究显示，口服SP@Rh-gel可抑制NF-κB–Caspase-1信号通路，减轻肠道炎症，并帮助重建紊乱的肠道菌群，恢复肠道稳态。此外，该策略能够维护肠道屏障完整性，减少促炎细胞因子与脂多糖的释放，并阻断其经血脑屏障向海马等脑区的渗透，进而抑制神经炎症、维持神经可塑性。在慢性结肠炎小鼠模型中，SP@Rh-gel显著缓解了结肠炎症状及焦虑、抑郁样行为。该研究揭示了微生物‑肠‑脑轴在IBD及相关精神共病发生中的关键作用，并提供了一种安全、简便且高效的治疗新策略，为IBD及其神经精神并发症的综合管理提供了新思路。该文章于2024年1月16日以《Microalgae-Based Hydrogel for Inflammatory Bowel Disease and Its Associated Anxiety and Depression》为题发表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.202312275）。

方案1：自组装微藻/草药成分水凝胶用于治疗炎症性肠病及其相关焦虑和抑郁

（1）SP@Rh-Gel 的合成与表征

Rh水凝胶（Rh-gel）采用直接自组装法合成，随后加入螺旋藻（SP）获得具有三维网络结构的SP@Rh-gel（图1a）。Rh的凝胶化浓度为4 mg mL⁻¹，仅当Rh浓度高于该阈值时才能形成水凝胶（图1b）。Rh-gel由纳米纤维构成，形成三维多孔网络结构（图1g）。X射线衍射分析显示在d = 3.4 Å处存在特征峰，提示π–π堆积作用驱动自组装（图1f）。SP长度约100 μm，具有螺旋结构，在适当光激发下发射红色荧光（图1h）。SP@Rh-gel的伪彩色扫描电镜图像显示SP（绿色）分布于Rh-gel网络（红色）中（图1j）。紫外-可见光谱同时显示SP（约680 nm）和Rh-gel（约293 nm与437 nm）的特征吸收峰（图1k）。SP@Rh-gel在pH 1.8（模拟胃环境）中释放极少，在pH 7.4（模拟肠环境）中72小时内Rh释放接近完全（图1m、图1n）。

图1 SP@Rh-gel的合成与表征。（a）Rh-gel与SP@Rh-gel的合成路线示意图；（b）不同浓度Rh形成的水凝胶照片；（c）Rh-gel样品的紫外-可见吸收光谱；（d）Rh-gel样品的荧光光谱；（e）Rh-gel样品的Zeta电位（n = 3）；（f）Rh-gel样品的X射线衍射图谱；（g）Rh-gel的低倍（左）与高倍（右）扫描电镜图像，比例尺分别为10 μm与1 μm；（h）SP的明场（左）与荧光（右）显微镜图像，比例尺为50 μm；（i）Rh溶液、Rh-gel与SP@Rh-gel的照片；（j）SP@Rh-gel的伪彩色扫描电镜图像，其中SP呈绿色，Rh-gel呈红色，比例尺为10 μm；（k）Rh-gel、SP与SP@Rh-gel的紫外-可见吸收光谱；（l）Rh溶液、Rh-gel、SP与SP@Rh-gel的Zeta电位（n = 3）；（m）SP@Rh-gel在不同pH值PBS溶液中的Rh累积释放曲线（n = 3）；（n）SP@Rh-gel在pH 1.8与7.4的PBS中释放介质照片。

（2）荧光成像特性和生物分布

SP@Rh-gel在Rh通道（Ex: 460 nm; Em: DsRed）和SP通道（Ex: 605 nm; Em: Cy5.5）下均呈现强荧光信号，表明其合成后保留了各组分荧光特性（图2a）。体内成像显示，灌胃SP@Rh-gel后，其胃肠道内的SP或FITC（标记Rh）荧光信号强度分别达到单独给药组的2.4倍和3.3倍，且信号滞留时间更长（图2b,c）。离体器官荧光成像表明，SP@Rh-gel灌胃后迅速经胃转运，主要分布于回肠，随后逐渐向盲肠和结肠迁移，且未在心、肝、脾、肺、肾等主要脏器检出信号（图2d）。肠道组织冰冻切片显示，SP@Rh-gel组的SP（叶绿素）与Rh（FITC）荧光信号较单独给药组更强（图2e）；伪彩色电镜图像进一步证实SP（绿色）与Rh水凝胶（红色）嵌入小鼠肠绒毛结构（粉色）中（图2f）。此外，对胃肠道内容物的电镜观察显示，SP在胃中结构相对完整，在回肠部分断裂，在盲肠进一步降解，在结肠完全解离为碎片（图2g）。结果表明，SP@Rh-gel的水凝胶剂型能有效提高Rh与SP在胃肠道的局部浓度与滞留时间，并具有良好的口服生物可降解性。

图2 SP@Rh-gel的荧光成像特性与生物分布。（a）Rh溶液、SP与SP@Rh-gel分别在Rh通道和SP通道下的体外荧光成像；（b）灌胃给予SP@Rh-gel后小鼠在不同时间点的体内荧光成像；（c）各时间点小鼠荧光强度的定量分析；（d）灌胃后不同时间点小鼠主要器官的离体荧光成像；（e）灌胃给予SP、Rh溶液、Rh-gel及SP@Rh-gel后小鼠肠道组织的荧光显微镜图像；（f）灌胃SP@Rh-gel后小鼠肠道组织的扫描电镜图像（左）与伪彩色电镜图像（右）；（g）灌胃SP@Rh-gel后小鼠胃肠道不同部位内容物的明场显微镜图像（上）与扫描电镜图像（下）。

（3）炎症性肠病小鼠模型的行为变化

基于SP@Rh-gel的体外抗炎作用，通过DSS诱导建立慢性IBD小鼠模型，评估其对结肠炎及相关焦虑抑郁样行为的治疗效果。行为学测试显示，DSS组小鼠在旷场实验中央区停留时间减少（图3e），在高架十字迷宫中开放臂停留时间及进入次数下降（图3f,g），在强迫游泳实验和悬尾实验中不动时间延长（图3h,i）。而Rh-sol、Rh-gel及SP@Rh-gel组均能改善这些行为指标，其中SP@Rh-gel对焦虑和抑郁样行为的缓解作用最为显著。结果表明，SP@Rh-gel主要通过微生物-肠-脑轴发挥对IBD相关精神障碍的治疗作用。

图3 SP@Rh-gel改善DSS诱导的焦虑与抑郁样行为变化。（a）模型构建与药物干预流程示意图；（b）旷场实验中小鼠的运动轨迹与热图；（c）高架十字迷宫实验中小鼠的运动轨迹与热图；（d）旷场实验中的总运动距离；（e）旷场实验中央区停留时间；（f）高架十字迷宫开放臂停留时间及（g）进入次数；（h）强迫游泳实验不动时间；（i）悬尾实验不动时间。

（4）对神经可塑性与海马成体神经发生的调控

行为实验结果表明，DSS诱导的慢性结肠炎可能通过小胶质细胞介导的炎症途径引发神经毒性，进而导致海马炎症与海马神经可塑性损伤。在海马组织中，DSS处理使标记新生神经元的BrdU+/NeuN+细胞与标记未成熟神经元的DCX+细胞密度显著降低，而SP@Rh-gel治疗则显著提高了这两类细胞的数量（图4a-d）。尼氏染色显示，DSS组海马齿状回和CA3区尼氏阳性活神经元减少，Rh-gel或SP@Rh-gel治疗逆转了该现象（图4e-g）。此外，DSS组海马齿状回中小胶质细胞活化标记物Iba1的表达显著上升，SP@Rh-gel处理则明显降低了Iba1的表达（图4h,i）。

（5）对海马炎症的调节

通过RT-qPCR评估小胶质细胞M1/M2表型标记物的mRNA表达，以分析SP@Rh-gel对海马炎症的影响。Rh-sol、Rh-gel及SP@Rh-gel治疗均能显著降低M1型小胶质细胞标志物TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表达（图4j）。在所有治疗组中，仅SP@Rh-gel处理显著提升了M2型标志物Arg-1和CD28的mRNA表达（图4k）。各治疗组间NF-κB与IL-6的mRNA表达无显著变化（图4l）；但DSS组海马中caspase-1与NLRP3的mRNA表达经Rh-gel或SP@Rh-gel治疗后显著降低，IL-1β的mRNA表达在DSS组升高后亦经Rh-sol、Rh-gel或SP@Rh-gel治疗而下降。Western blot分析显示，DSS组NLRP3蛋白表达升高，而Rh-gel与SP@Rh-gel治疗降低了其表达；DSS组磷酸化NF-κB p65（p-P65）蛋白水平同样升高，并在Rh-gel与SP@Rh-gel组回落（图4m-o）。

图4. SP@Rh-gel对结肠炎小鼠神经可塑性和海马成年神经发生的影响。（a）海马DG区BrdU和NeuN双染色；（b）海马DG区DCX染色；（c）各组BrdU+/NeuN+细胞定量；（d）各组DCX阳性神经元定量；（e）海马DG和CA3区尼氏染色；（f）DG区活神经元数量；（g）CA3区活神经元数量；（h）海马DG区Iba1染色；（i）Iba1阳性神经元数量；（j–l）M1和M2小胶质细胞标记物及促炎细胞因子mRNA表达；（m–o）海马NLRP3和p-P65蛋白水平。

（6）对肠道炎症的抗炎效应

在DSS诱导的慢性结肠炎模型中评估了SP@Rh-gel对肠道炎症的影响（图5a）。DSS组小鼠平均体重低于对照组和SP@Rh-gel组（图5b）。DSS引起的直肠出血和腹泻等症状经SP@Rh-gel给药后得到缓解（图5c）。DSS组出现明显的结肠缩短（6.33 ± 0.53 cm），而Rh-sol、Rh-gel和SP@Rh-gel治疗显著减轻了结肠缩短（图5d,e）。SP@Rh-gel治疗也缓解了DSS诱导的脾脏肿大（图5f,g）。组织病理学检查显示，DSS组肠上皮和隐窝结构严重受损，而SP@Rh-gel组保持了完整的上皮屏障结构（图5h）。免疫组化分析表明，与DSS组相比，SP@Rh-gel组结肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的表达更低（图5i）。组织病理学评分及促炎细胞因子定量分析结果一致，SP@Rh-gel组的组织学评分显著降低（图5j）。

图5. SP@Rh-gel对肠道炎症的抗炎作用。（a）DSS诱导慢性结肠炎小鼠模型示意图；（b）治疗期间小鼠体重；（c）各组小鼠直肠出血情况；（d）各组小鼠盲肠与结肠组织外观；（e）各组结肠长度；（f）各组脾脏组织外观；（g）各组脾脏重量；（h）各组结肠组织H&E染色（上：低倍；下：高倍）；（i）各组结肠组织TNF-α、IL-6和IL-1β免疫组化染色；（j）各组组织病理学评分及TNF-α、IL-6和IL-1β相对强度。

（7）对肠道上皮屏障功能障碍的保护作用

免疫荧光染色显示，与对照组相比，DSS诱导的结肠炎中紧密连接蛋白claudin-1、occludin-1与ZO-1的表达显著降低（图6a,b）。RT-qPCR分析进一步证实，SP@Rh-gel治疗后结肠组织中TNF-α、IL-6与IL-1β的mRNA表达显著降低（图6c）。透射电镜图像显示SP@Rh-gel对结肠紧密连接及微绒毛结构具有保护作用（图6d）。在LPS诱导的Caco-2单层细胞模型中，Rh-sol、Rh-gel与SP@Rh-gel处理均能提升上皮电阻值（图6f），并显著抑制LPS引起的肠道通透性升高（图6g）。

图6. SP@Rh-gel对DSS诱导的肠道上皮屏障功能障碍的保护作用。（a）各组结肠claudin-1、occludin-1与ZO-1免疫荧光染色；（b）各连接蛋白mRNA表达定量（n=6）；（c）结肠TNF-α、IL-1β与IL-6 mRNA表达RT-qPCR分析（n=6）；（d）各组结肠TEM图像；（e）SP@Rh-gel在LPS诱导Caco-2细胞模型中的保护作用示意图；（f）Caco-2细胞单层Teer值（n=3）；（g）Caco-2细胞单层FD4通量。

（8）肠道微生物群和微生物代谢物的调控

通过16S rDNA测序分析DSS暴露及不同治疗后小鼠的肠道微生物群特征。各组间的α多样性指数（如Chao1指数）无显著变化（图7a）。β多样性主坐标分析显示，DSS组与对照组及SP@Rh-gel组间的微生物组成存在显著差异（图7b）。门水平和属水平的群落分析展示了各组的微生物相对丰度（图7c,d）。LEfSe分析鉴定出SP@Rh-gel组与DSS组间的差异微生物组成（图7e），SP@Rh-gel口服上调了Ligilactobacillus、Faecalibacterium等多类细菌的丰度。BugBase预测分析表明，SP@Rh-gel给药显著降低了慢性结肠炎小鼠中革兰氏阴性菌的丰度（图7f）。对粪便代谢物的分析显示，PCA得分图表明不同处理组肠道微生物代谢物存在差异分布（图7g）。OPLS-DA分析进一步揭示了DSS组与对照组及SP组间代谢物的定量差异（图7h）。火山图展示了组间差异代谢物（图7i），DSS组中发生变化的130种代谢物水平经SP@Rh-gel治疗后得到部分恢复。

图7. 16S rDNA测序与粪便代谢组学分析。（a）各组Alpha多样性指数比较；（b）基于Jaccard距离的PCoA图；（c）门水平微生物相对丰度群落柱状图；（d）属水平微生物相对丰度群落热图；（e）LEfSe分析获得的分类进化分支图；（f）BugBase预测的革兰氏阴性菌相对丰度；（g）各组微生物代谢物PCA得分图；（h）DSS组与SP@Rh-gel组间的OPLS-DA得分图；（i）两组间差异代谢物的火山图；（j）差异代谢物的KEGG通路富集分析。

（9）体外增殖与神经突生长的调控

通过LPS激活的BV-2小胶质细胞与PC-12细胞的共培养模型，评估了SP@Rh-gel对神经元增殖与神经突生长的神经保护作用（图8a）。与LPS组及LPS+SP组相比，经Rh-sol、Rh-gel和SP@Rh-gel处理后，PC-12细胞表现出更长的神经突和更多的分支（图8b-d）。在原代神经元与小胶质细胞共培养体系中，LPS+Rh-sol、LPS+Rh-gel和LPS+SP@Rh-gel组相比LPS组神经突生长显著增加，神经元凋亡减少，表现为Tuj1荧光信号增强且TUNEL阳性细胞数量下降（图8e-h）。

图8. SP@Rh-gel对体外增殖与神经突生长的影响。（a）细胞处理方案示意图；（b）各组PC-12细胞DAPI与Tuj1免疫荧光染色；（c）PC-12细胞神经突长度及（d）分支总数统计；（e）细胞处理方案示意图；（f）各组原代神经元DAPI/Tuj1/TUNEL免疫荧光染色；（g）原代神经元Tuj1荧光相对强度；（h）TUNEL阳性细胞定量。