针对上述问题，中国医科大学徐晓倩教授、杨华哲教授与东北大学徐大可教授设计了Zn²⁺/Ce³⁺双掺杂的WH纳米颗粒GelMA模板（GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH）。这些仿生GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH水凝胶支架表现出优异的抗氧化作用，显著激活抗炎症巨噬细胞表型并抑制破骨细胞生成。由此产生的免疫微环境有利地促进了成骨分化体外和体内促进种植体与骨的骨整合。此外，支架显示了潜力用于术后抗感染活性。值得注意的是，GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH表现出优异的整体性能。总之，天然骨样Zn²⁺/Ce³⁺共掺杂策略赋予GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH免疫调节作用，提供了一个独特的和有前途的重建方法用于骨再生的免疫调节成骨微环境。该文章于2025年11月20日以《Immune regulative GelMA&Zn²⁺/Ce³⁺-whitlockite scaffolds with continuous ions release for bone regeneration》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2025.11.009）。

图1 GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架在骨缺损修复与抗菌治疗中的制备及功能示意图

（1）离子掺杂WH纳米粒子的结构表征

SEM显示（图2A），纯WH呈均匀菱形（150 nm），Zn²⁺-WH保持菱形但粒径减小（90 nm），而Zn²⁺/Ce³⁺-WH则呈不规则形态（5-60 nm）。XRD分析（图2B）表明，掺杂导致特征峰向低角度偏移，证实Zn²⁺（替代Mg²⁺）和Ce³⁺（替代Ca²⁺）成功嵌入晶格并引起晶格膨胀。TEM-EDS元素面扫描（图2D）进一步显示Ca、P、O、Mg、Zn、Ce在Zn²⁺/Ce³⁺-WH中均匀分布。FTIR谱图（图2E）证实掺杂未改变WH基本化学结构。将纳米颗粒负载于GelMA制得复合支架，其具备高孔隙率（80%）与适宜溶胀性（图2I，J）。体外降解30天后质量损失可控（图2F）。力学测试表明（图2K），离子掺杂WH显著增强了支架的压缩模量。

图2 Zn²⁺/Ce³⁺-WH纳米粒子及GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH复合水凝胶支架的表征。A）WH、Zn²⁺-WH及Zn²⁺/Ce³⁺-WH纳米粒子的代表性SEM图像。B）离子掺杂WH纳米粒子的XRD分析。C）透射电子显微镜图像，插图显示3#晶面（0 1 2）的晶面间距为8.059 A。D）透射电子显微镜能谱与元素色散图，显示3#晶面对应元素Zn、Ce、Ca、Mg、P和O。E）离子掺杂WH纳米粒子的傅里叶变换红外光谱分析。F）复合支架在PBS中的降解速率。G）代表性SEM图像。H）纳米复合GelMA水凝胶合成流程示意图。I）复合支架在PBS中的平衡膨胀率。J）复合支架膨胀率。K）纳米复合GelMA水凝胶的抗压强度。

（2）纳米复合材料GelMA水凝胶支架的细胞相容性

细胞相容性测试显示（图3A-C），MC3T3-E1细胞在支架表面粘附良好、铺展充分并呈现活跃增殖（图3E），且Zn²⁺与Ce³⁺的累积释放浓度处于生物安全范围内（图6A-B）。溶血实验证实（图3D，F），离子掺杂显著改善了材料的血液相容性，Zn²⁺/Ce³⁺-WH（如3#、4#）的溶血率低于2%，满足植入要求。抗菌性能评估显示，该支架对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）与革兰氏阴性（大肠杆菌）菌均具有显著抑制作用。菌落计数与活/死染色（图3I-M）表明，Zn²⁺与Ce³⁺的协同作用可破坏细菌膜完整性并干扰代谢，其中4#抑菌效果最强。结晶紫染色与TEM观察进一步证实（图3G-H），该材料能有效破坏已形成的细菌生物膜，引起细菌超微结构损伤。

图3 支架的生物相容性与抗菌效果。A）纯GelMA、GM&Zn²⁺-WH及GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架上MC3T3-E1细胞的活/死染色。C）不同表面上MC3T3-E1细胞的SEM图像。D）不同纳米颗粒的溶血图像。E）MC3T3-E1细胞与各类样本提取物共培养1、3、5天后的细胞活力（CCK8检测法测定）。F）不同纳米颗粒溶血率。G,H）金黄色葡萄球菌与大肠杆菌经GelMA、GM&WH、1#-4#提取物共培养24小时后的结晶紫染色及透射电镜图像。I）大肠杆菌菌落计数代表性图像。J）金黄色葡萄球菌菌落计数代表性图像。K-M）纳米复合水凝胶提取物共培养4、6、8小时后大肠杆菌菌落计数的统计图。N-P）统计图表显示纳米复合水凝胶提取物与金黄色葡萄球菌共培养6、8和10小时后的菌落计数。

（3）巨噬细胞对纳米复合材料GelMA水凝胶支架的骨免疫系统反应评估

GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架展现出显著的骨免疫调节功能，能有效引导巨噬细胞向促进愈合的M2表型极化。细胞活力检测（图4J）表明，含微量Zn²⁺/Ce³⁺的提取物（尤其3#）可促进RAW264.7细胞增殖。免疫荧光与流式细胞术分析显示，与对照组及GM&WH相比，1#-4#提取物处理的巨噬细胞其M2标志物CD206表达显著上调（图4A-B），其中1#和3#效果最为显著，这得益于Zn²⁺的浓度调节与Ce³⁺的协同作用。同时，该处理未显著改变M1标志物CD86的表达（图4C-D），但3#组的M1（CD86+、CD11b+）细胞比例最低（图4G）。3#提取物表现出强大的ROS和NO清除能力（图4H、I、K）。此抗炎与促M2极化的效应在原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中得到进一步验证（图5A-D）。

图4 支架中免疫炎症的评估。A、B）RAW264.7细胞与不同样本提取物共培养后的免疫荧光染色结果及CD206定量荧光强度。C、D）不同样本提取物共培养下RAW264.7细胞中CD86的免疫荧光染色结果及定量荧光强度。E、F）不同样本提取物共培养下RAW264.7细胞中CD163的免疫荧光染色结果及定量荧光强度，CD163呈红色。E、F）RAW264.7细胞与不同样本提取物共培养后CD163的免疫荧光染色结果及定量荧光强度。G）流式细胞术分析炎症性RAW264.7细胞中CD86和CD11b阳性细胞比例。H）荧光酶标法定量分析巨噬细胞内ROS含量。I）RAW264.7细胞与不同样本提取物共培养1、3、5天后的细胞活力。J）不同样本提取物共培养下RAW264.7细胞的NO含量。K）采用DCFH-DA荧光探针检测不同样本提取物刺激后巨噬细胞的ROS含量。

（4）GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH促进巨噬细胞极化

GM&WH、GM&Zn²⁺-WH样本显示，其有效调节了巨噬细胞从M0向M2的极化过程，因此在骨组织修复方面展现出潜力。同样经提取物处理的骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）中CD86、CD206和CD163的表达趋势与RAW264.7细胞一致（图5A-D），该纳米复合材料在原代巨噬细胞中同样具有强效抗炎作用。

图5 支架中免疫炎症（BMDM）的评估。A、B）与不同样本提取物共培养的BMDM细胞中CD86的免疫荧光染色结果及定量荧光强度，CD86（M1标记物）呈绿色（比例尺=50 μm）。C、D）不同样本提取物共培养BMDM细胞中CD163（M2标志物）的免疫荧光染色结果及定量荧光强度，CD163呈绿色（比例尺=50 μm）。

（5）通过氧化作用实现GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH对•OH自由基清除能力的可能机制

XPS分析（图6B）证实3#样品中同时存在Ce³⁺和Ce⁴⁺态。ESR谱显示（图6C-D），该材料能有效清除羟基自由基（·OH）与超氧阴离子（O₂·⁻）。DCFH-DA染色表明3#提取物可显著降低H₂O₂诱导的RAW264.7细胞内ROS水平（图6E-F）。MDA检测也证实其能减轻脂质过氧化损伤（图6J）。同时，JC-1染色与ATP测定显示（图6H，K），3#能有效维持线粒体膜电位并改善能量代谢，表明其具有细胞保护作用。Western blot分析（图6L-M）揭示GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH能抑制NF-κB信号通路关键蛋白P65和IκBα的磷酸化。Zn²⁺直接贡献于NF-κB的抑制与ROS清除，而Ce³⁺/Ce⁴⁺循环则稳定并增强了这一抗氧化抗炎效应，共同阻断炎症级联反应，为骨再生创造有利的微环境。

图6 GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH对细胞的抗氧化损伤保护作用。A）示意图展示GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH的抗氧化活性。B）Zn²⁺/Ce³⁺-WH纳米颗粒中Ce3d区域的高分辨率XPS光谱。c.p.s.表示每秒计数。C，D）以5,5-二甲基-1-吡咯烷酮N-氧化物（DMPO）为捕获剂，通过ESR谱学在PBS中测定纳米颗粒对•OH（C）和O₂•-（D）自由基清除能力。E，F）不同样品提取物刺激后巨噬细胞内DCFH-DA荧光探针检测（经H₂O₂处理）。G）GM&WH、1#和3#的SOD样抗氧化活性。H）不同样本提取物共培养后JC-1染色的RAW264.7细胞荧光图像。I）分别经GM&WH、1#和3#处理后再经H₂O₂孵育的RAW264.7细胞存活率。J，K）不同样本提取物共培养下RAW264.7细胞脂质过氧化水平及ATP生成量定量分析。L）不同水凝胶提取物处理后RAW264.7细胞中P65、磷酸化P65、IκBα、磷酸化IκBα及TNF-α的Western blot分析。GAPDH作为内参进行加载控制。M）示意图展示Ce³⁺通过抑制NF-κB信号通路调节炎症反应的抗炎机制。

（6）体外评估纳米复合GelMA水凝胶的骨传导活性

GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架在体外展现出优异的促成骨活性。ALP染色（图7A）与定量分析（图7E）表明，经其提取物（尤其是3#）处理的MC3T3-E1细胞，其ALP活性在第7天和第14天均显著高于对照组及单离子掺杂组，3#的成骨诱导活性约为对照组的1.44倍。ICP-MS离子释放曲线显示（图7C-D），3#能持续释放Zn²⁺和Ce³⁺，且浓度适中（14天时分别为296.00 ppb和60.91 ppb），处于最佳成骨浓度范围。而过量释放离子的4#组成骨效果反而减弱。茜素红染色证实（图7B，F），3#能诱导形成大量、致密的钙结节，其矿化程度是对照组的1.37倍。分子机制上，RT-qPCR显示（图7F-I），3#处理能显著上调关键成骨基因RUNX2、BMP2、OPN和OCN的表达。免疫荧光与Western blot进一步在蛋白水平验证了BMP2和RUNX2的上调（图7K-N）。综上，3#支架通过Zn²⁺与Ce³⁺的协同缓释，有效激活了成骨细胞的分化与矿化功能。

图7 展示纳米复合水凝胶在体外促进MC3T3-E1细胞成骨分化及成骨基因表达的效果。A）纳米复合水凝胶在PBS（pH7.4）中释放Zn²⁺、Ce³⁺（A）和Mg²⁺（B）离子的累积释放曲线（0、7和14天）。C）碱性磷酸酶染色：经水凝胶提取物处理7天和14天的MC3T3-E1细胞宏观视图（比例尺=50μm）及染色图像（比例尺=100μm）。D）ARS染色：经水凝胶提取物处理14天和21天的MC3T3-E1细胞宏观视图（比例尺=50μm）及染色图像（比例尺=100μm）。E）采用ALP酶活性检测试剂盒在诱导14天后进行的ALP活性定量分析。F）诱导21天后钙沉积定量分析。G-J）BMP2、OCN、OPN及RUNX2的mRNA表达水平。K-L）经水凝胶提取物处理14天后MC3T3-E1细胞中BMP2蛋白表达的免疫荧光染色（K）、定量分析及Western blot检测（L）。M−N）培养7天后MC3T3-E1细胞中RUNX2表达的免疫荧光染色（M）与定量分析（N）。

（7）纳米复合材料GelMA水凝胶支架的破骨细胞体外评估

该支架在体外展现出抑制破骨细胞生成与活性的能力。TRAP染色及活性分析（图8A，B）显示，纯WH提取物因含Mg²⁺而略微促进破骨细胞分化。相比之下，离子掺杂样本（1#-4#）的TRAP阳性细胞数量与活性均显著降低，且抑制作用随Zn²⁺浓度增加而增强。GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH组（如3#）的抑制作用略弱于GM&Zn²⁺-WH组，可能与低浓度Ce³⁺的轻微促破骨效应有关，但其整体仍显著抑制破骨细胞生成。进一步通过鬼笔环肽染色评估细胞骨架（图8C），发现经3#提取物处理后，破骨细胞特征性的F-肌动蛋白环形成明显受抑，骨吸收面积显著减小，表明其破骨功能受损。综上所述，GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架在具备良好成骨与免疫调节性能的同时，能有效抑制破骨细胞的分化与骨吸收功能。

图8 RANKL诱导巨噬细胞的条件培养基对体外破骨细胞分化的影响。A）经RANKL处理的RAW264.7细胞与不同样本提取物共培养后的TRAP染色。B）在OD405nm波长下测定TRAP酶活性。C）RANKL处理的RAW264.7细胞与不同样本提取物共培养后的鬼笔环肽染色。

（8）纳米复合水凝胶的体内成骨潜能

GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架在体内展现出优异的骨缺损修复能力。CT扫描（图9B）显示，植入8周后，3#样本的缺损区域显著缩小，新生骨形成明显多于对照组。定量分析表明（图9C-F），术后8周时3#组的骨体积/组织体积（BV/TV）高达48.23%，分别是4#、GM&WH和对照组的1.3倍、1.6倍和2倍；其骨小梁厚度与数量也显著优于其他组。这种卓越的再生效果归因于支架的协同作用：Zn²⁺与Ce³⁺的持续释放有效诱导了M2型巨噬细胞极化，营造了抗炎成骨微环境；同时，Zn²⁺抑制破骨细胞分化，而WH组分直接促进成骨。综合表明，3#支架能通过免疫调节与直接成骨双重机制，有效促进临界尺寸骨缺损的再生。

图9 纳米复合水凝胶促进体内骨修复。A）动物实验流程图。B）植入后4周和8周样本的代表性三维重建图。C-F）基于骨体积/总体积比（BV/TV）、骨节段数（Tb.N）、骨节段间距（Tb.Sp）及骨节段厚度（Tb.Th）对股骨缺损部位骨形成进行定量评估。

（9）纳米复合水凝胶免疫调节特性的体内评估

体内组织学分析进一步证实了GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架卓越的骨修复与整合能力。H&E染色（图10A）显示，植入8周后，3#支架组缺损区细胞活跃迁移并广泛覆盖支架中心，形成连接缺损边缘的大型骨桥，新生骨组织更为致密成熟。Masson染色（图10B）表明，3#组在4周和8周时均呈现更多的红色成熟骨胶原沉积，而对照组则以蓝色未成熟编织骨或纤维组织为主。免疫组化结果显示（图10C，E-F），3#组中关键成骨蛋白BMP2与OPN的表达水平显著高于其他组，与体外基因表达结果一致。此外，TRAP染色（图10D）显示材料处理组的破骨细胞活性显著降低，印证了其体外抑制破骨细胞分化的功能。

图10 股骨缺损组织学及免疫组化（IHC）染色以评估新骨形成。A）术后8周股骨组织HE染色全景图（比例尺=500μm）及放大视图（比例尺=50μm）。B）术后8周股骨组织Masson染色全景图（比例尺=500μm）及放大图（比例尺=50μm）。黑色箭头：新生骨。C）术后8周股骨组织免疫组化染色（BMP2和OPN）（比例尺=50μm）。D）术后8周股骨组织TRAP染色（比例尺=50μm）。E,F）术后8周阳性区域半定量分析（BMP2和OPN）。

（10）纳米复合材料GelMA水凝胶的体内骨-免疫调节作用

体内研究表明，GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH支架能有效调控骨免疫微环境以促进再生。免疫荧光分析（图11A-C）显示，植入后第4周和第8周，3#样本新生骨组织中的M1/M2巨噬细胞比例均显著低于对照组及GM&WH组，表明其能持续诱导巨噬细胞向M2抗炎表型极化，并建立利于成骨的微环境。

图11 GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH对免疫微环境的体内调控。A）术后第4周和第8周，通过免疫荧光染色评估支架的免疫调节功能：a）CD86和b）CD206（比例尺=50μm）。B）术后第4周CD86+/CD206+细胞半定量分析。C）术后第8周CD86+/CD206+细胞半定量分析（n=6）。

图12. GM&Zn²⁺/Ce³⁺-WH复合水凝胶的体内功能机制