针对上述问题，西北工业大学材料学院纳米能源材料研究中心尚利教授、谭丽丽副教授团队设计构建了pH响应性的超分子自组装纳米囊泡药物用于铁死亡/凋亡协作抗瘢痕治疗策略。在该研究中，利用CB与双氢青蒿素（DHA）之间的主-客体识别作用，包裹金纳米团簇（AuNCs）以及DHA，自组装形成超分子纳米囊泡药物-CAD NPs。构筑的CAD NPs具有较高的药物负载率和智能pH响应性。其中，AuNCs可以产生活性氧，消耗细胞内的谷胱甘肽，而DHA可以激活氧化应激信号通路诱导铁死亡。此外，AuNCs与DHA能够协同消耗细胞谷胱甘肽含量，抑制谷胱甘肽过氧化酶4的活性，阻断脂质过氧化清除能力，增强活性氧产生，导致线粒体损伤，进而同时引发铁死亡/细胞凋亡，最终实现了抗瘢痕疗效的显著增强。该治疗策略在兔耳瘢痕模型上表现出了优异的治疗效果，不仅能够缩短瘢痕治疗周期，而且显著改善了瘢痕外观。该文章于2024年11月26日以《Supramolecular Assembly-Enabled Transdermal Therapy of Hypertrophic Scarring Through Concurrent Ferroptosis-Apoptosis》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI:10.1002/adfm.20241601）。

示意图.超分子自组装CAD NPs及其通过铁凋亡/死亡协作抗瘢痕作用机制

（1）CAD NP的制备与表征

GSH-AuNCs呈单分散球形，粒径2.3±0.8 nm，红色荧光（图1A）。CAD NPs由CB-DHA主-客体复合物与AuNCs共混获得，TEM示球形囊泡平均直径98.4 nm（图1B），DLS流体力学直径258.3 nm，ζ电位−12.6 mV；HAADF-STEM证实S与Au均匀分布（图1C）。封装后荧光强度较游离AuNCs提高5倍，寿命由2.3 μs延长至4.4 μs。SAXS出现4.2、2.3、1.1 nm三处散射峰（图1E），分别对应囊壁厚度、AuNCs及CB尺寸。ICP-MS与UV-Vis测得AuNCs和DHA包封率各为90.5±2.6%与82.3±3.1%。24 h pH响应释放：pH 7.4时DHA释放32.3%，pH 5.0升至62.3±6.7%，AuNCs同步酸敏释放（图1F）。

CB与DHA自组装为厚度4.3 nm的球形囊泡。¹H NMR中DHA羟基质子及相邻甲基向低场位移；FTIR羟基（3364 cm⁻¹）、C=O（1709 cm⁻¹）红移，C−O（1021 cm⁻¹）峰移，环状亚甲基C−H（1440 cm⁻¹）峰消失；ESI-MS于m/z 1445.5检出[CB/DHA−H]⁻，确证1:1复合物。分子对接显示DHA羟基及相邻甲基嵌入CB空腔，结合能−4.68 kcal mol⁻¹（图1G），复合物伸展长度≈3.0 nm。囊泡由氢键、疏水作用及范德华力驱动形成亲水内腔双层结构，AuNCs经被动扩散稳定载入，构成CAD NPs（图1H）。

图1 超分子自组装CAD非药物的合成与表征。A）GSH-AuNCs的透射电子显微镜图像及尺寸直方图（内嵌）。B）CAD名点的透射线图图像及尺寸直方图（内嵌）。C）通过HAADF放大的CAD自然线图及相应元素映射图像。D）在水溶液中AuNCs和CAD非泡泡在相同浓度的Au下进行荧光发射光谱。激发波长：365纳米。E）CAD NPs的小角度X射线散射二维剖面图。F）体外释放不同pH（n = 3）下CAD NP中DHA的动力学。G）CB/DHA分子连接结果的俯视图。H）CB和DHA 的化学结构，以及 CAD NP 的示意图。

（2）CAD NPs的体外抗纤维化特性

评估CAD NPs对HSFs的体外细胞毒性显示，0–100μM CB或AuNCs处理48小时对细胞存活率无显著影响，而25–100μM DHA和CAD NPs处理使存活率逐渐下降，其中CAD NPs毒性更强，IC50为48.6±3.8 μM（图2A）。亚细胞定位分析显示，CAD NPs在1小时内与溶酶体强烈共定位，Pearson系数达0.8（图2B），荧光强度在12小时和24小时逐步下降，提示降解发生；ICP-MS测得细胞内金含量在12小时内增加随后下降。Western blot显示CAD NPs使α-SMA、Col-I和Col-III蛋白表达分别降至对照组的20%、30%和40%（图2C，2D），CLSM免疫荧光证实α-SMA表达降低，平均荧光强度下降55.1%（图2E）。铁死亡抑制剂DFO或凋亡抑制剂Ac-DEVD-CHO可上调上述纤维化蛋白水平（图2C–E），表明铁死亡与凋亡共同参与CAD NPs的抗纤维化作用。

图2 CAD NPs的体外抗纤维化效果。A）CADNPs在HSFs上48小时的细胞存活率（n=3）。B）HSFs与CAD NPs及溶酶体追踪器在1、12和24小时孵育的CLSM图像。C）不同处理下HSFs纤维化相关蛋白的西印迹分析（n=3）。D）纤维化相关蛋白的密度定量分析。E）不同处理HSFs中α-SMA的免疫荧光染色，其中细胞核用4′，6-二酰胺-2-苯哋哆尔染色。

（3）CAD NPs的同时铁消亡-凋亡机制

TEM显示CAD NP处理的HSFs呈现线粒体体积缩小、嵴减少等铁死亡特征，DFO可抑制这些变化。流式检测表明CAD NP显著降低MMP，该效应可被DFO逆转（图3A）。DCFH-DA探针检测显示CAD NP处理后ROS水平较对照组升高189.7%，DFO处理使其降至145.3%（图3B）。CAD NP使HSFs内GSH减少45.3%±4.8%、MDA表达增加2.4倍，并下调GPX4活性至对照组0.6倍，上述变化均可被DFO逆转（图3C-F）。这些结果证实铁死亡参与CAD NPs的抗纤维化过程。

图3 CAD NPs诱导的HSF铁坏死。A）通过流式细胞术定量计算的MMP结果，用于CAD NPs处理的HSFs（n = 3）。B）采用DCFH-DA染色的HSF细胞内ROS定量结果（n = 3）。C）测量用CAD非注射器处理的HSF细胞内GSH含量（n=3）。D）测量用CAD NP处理的HSF中MDA含量（n=3）。E）西方印迹图像。F）对用CAD NP处理的HSFs中GPX4的密度定量分析（n=3）。

图4 CAD NPs会在HSFs上触发半天冬酶-3依赖性的细胞凋亡。通过流式细胞术实现HSFs上CAD天然细胞的细胞凋亡（n=3）。B）细胞凋亡的统计分析。C）对CAD NP处理的HSFs中凋亡相关蛋白表达进行Western blot分析（n=3）。D） 细胞凋亡相关蛋白的密度定量分析。

流式细胞术显示CAD NP处理组HSFs凋亡率达75.9±5.7%，显著高于DHA组的47.8±3.9%，而CB与AuNCs无明显影响（图4A、B）。Western blot显示CAD NP使Bax表达上调至对照组1.5倍、caspase-3上调至2.7倍，Bcl-2下调至0.4倍，Ac-DEVD-CHO可逆转该趋势（图4C、D）。AO/PI染色进一步证实CAD NPs的促凋亡作用可被Ac-DEVD-CHO部分抑制。

机制上，释放的AuNCs产生ROS并消耗GSH，DHA则激活芬顿反应生成高水平ROS与脂质过氧化，二者协同增强氧化应激使GPX4失活，导致线粒体损伤，最终同时触发铁死亡与凋亡。该铁死亡-凋亡协同策略增强了CAD NPs的治疗效果。

（4）由CAD NPs进行的体内抗瘢痕治疗

溶血实验显示CAD NPs在25–100 μM浓度下溶血率<5%（图S20）。将CAD NPs载入GelMA微针（图5A），SEM表征显示微针呈锥形结构，高度约600 μm（图5B），机械强度测试表明其断裂力远超皮肤穿透所需的0.5 N。体外降解实验显示针尖在含0.5 μg/mL IV型胶原酶的PBS中90秒内快速溶解（图5C）。荧光显微镜证实AuNCs在微针内分布均匀。兔耳HS模型中，GelMA/CAD微针每周两次治疗三周后，瘢痕变平且颜色接近正常皮肤（图5E）。共聚焦成像显示微针穿透后1小时形成微孔，24小时开始扩散，48小时基本降解。三维超声显示GelMA/CAD组瘢痕厚度降至1.5±0.2 mm，显著低于对照组3.4±0.2 mm（图5F）。铁死亡抑制剂DFO或凋亡抑制剂Ac-DEVD-CHO可部分逆转该疗效（图5G），验证了铁死亡-凋亡协同机制的存在。

图5 兔子HS模型的体内经皮治疗。A）GelMA/CAD微针的制造工艺。B）GelMA/CAD微针的SEM图像。C）GelMA/CAD微针在具有IV型胶原酶的PBS中体外降解能力（n=6）。D）体内实验的时间节点。E）HS在GelMA/CAD微针贴片及其他组治疗前后形态变化。F）HS超声图像用于检测瘢痕厚度。G）通过GelMA/CAD微针治疗3周后超声检查HS瘢痕厚度。

H&E染色显示GelMA/CAD微针组心、肝、脾、肺、肾未见明显损伤，生化指标AST、ALP、肌酐、血尿氮均在正常范围内。组织学分析显示GelMA/CAD微针干预后瘢痕高度和颜色随时间减少（图6A），Masson三色染色显示胶原含量抑制率达46.1±5.8%（图6B、6E），DFO或Ac-DEVD-CHO可逆转该效应。免疫组化显示GelMA/CAD组GPX4阳性细胞降至对照组29.2%±6.5%（图6C、6F），TUNEL染色显示凋亡细胞数量约为对照组10倍（图6D、6G），证实铁死亡与凋亡共同参与治疗作用。该纳米平台较传统单药疗法提升了DHA溶解度与可用性，铁死亡-凋亡联合策略可克服化疗耐药，缩短治疗周期至三周，较硅胶凝胶和糖皮质激素等一线药物具有更好的临床应用前景。

图6 干预结束时对兔耳HS模型上的GelMA/CAD微针贴片进行组织学分析。A）H&E染色的图像。B）马松三色染色图像。C）GPX4的免疫组化染色。D）HS组织的TUNEL染色以检测凋亡细胞。白色虚线表示皮肤的表层。E）对胶原蛋白含量进行定量分析，采用Masson染色法。F）GPX4免疫组化染色的定量分析。G） TUNEL阳性细胞的定量分析。