针对上述问题，北京大学刘燕、王存玉、中国科学院罗聃以及华中科技大学龚士强团队受生物矿化启发，在M2型巨噬细胞来源的小细胞外囊泡（M2EV）表面原位生长磷酸钙纳米晶体，构建M2EV@CaP纳米杂合体；该矿化层既充当物理屏障，显著提升囊泡储存、抗降解与循环稳定性，又提供钙磷离子库，可在炎症酸性微环境智能释放，协同M2EV的免疫调节信号，实现“抗炎-促骨”双重增效。体外实验证实其在高糖炎症条件下能显著抑制M1极化、促进干细胞成骨分化；进一步将M2EV@CaP载入水凝胶，用于糖尿病大鼠颅骨缺损，获得明显优于天然M2EV的骨再生疗效，为糖尿病骨缺损治疗提供了稳定、高效、可转化的新方案。该文章于2025年10月1日以《Calcium Phosphate Nanoparticle-Immobilized Macrophage-Derived Extracellular Vesicle Nanohybrid Facilitates Diabetic Bone Regeneration》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202509410）。

研究示意图

（1）M2EV@CaP的制备和表征

首先图1a 给出整体流程示意图：M2EV 在富钙 DMEM 中通过静电吸附触发原位矿化。随后图1b 的 TEM 显示，2 h 时囊泡仍保持典型杯状轮廓但表面明显粗糙；延长至 4 h 则因过度沉积出现聚集，故后续实验统一采用 2 h 方案。图1c 的 EDS 元素映射进一步验证，Ca、P、O 在囊泡表面均匀共存，Ca/P 原子比≈1:1，确证 CaP 壳层形成。与此对应，图1d 的 DLS 测得粒径由 130.6 ± 8.8 nm 增至 197.5 ± 13.2 nm；图1e 的 AFM 力曲线表明弹性模量从 1.85 GPa 跃升至 4.35 GPa，提示机械稳定性显著增强。图1f 的 Zeta 电位由 −23.8 mV 升至 −20.4 mV，反映表面电荷因矿化而改变。图1g 的 FTIR 在 500–600 与 1000–1100 cm⁻¹ 出现 P–O 振动峰，同时保留 1500–1600 cm⁻¹ 的 C–O 峰，TGA 测得有机质占比约 30%，共同证明有机-无机杂化结构。为评估储存稳定性，图1h–k 将样品于 4 °C 放置 7 d：TEM 显示 M2EV 膜破裂并聚集，DLS 出现 <100 nm 与 >1000 nm 双峰，平均粒径增至 241.2 ± 42.6 nm，且 EV 标志蛋白表达下降；而 M2EV@CaP 仍呈完整球形，粒径仅轻微增至 216.2 ± 15.6 nm，Alix、TSG101、CD63、CD9 水平与新鲜样品相当，表明矿化壳有效抑制降解。最后，图1l–n 在 pH 6.0、37 °C 条件下模拟酸触发：TEM 显示 16 h 矿化壳几乎完全消失，DLS 粒径回降至 117.0 ± 7.7 nm；钙离子释放曲线表明 4 h 内释放率 >90%，而中性 pH 下不足 10%，从而证实 M2EV@CaP 具备优异的储存稳定性与酸响应控释性能。

图1. M2EV@CaP的制备和表征。a）M2EV@CaP的合成过程的示意图；;b）M2EV（阴性染色）和M2EV@CaP（未染色）的代表性TEM图像；c）M2EV@CaP的元素图谱分析； d）显示M2EV和M2EV@CaP的粒度分布（左）和平均直径（右）的DLS；E)M2EV和M2EV@CaP的杨氏模量图和半定量比较；f）M2EV和M2EV@CaP的Zeta电位；g）CaP和M2EV@CaP的FTIR光谱; h）用于评估M2EV@CaP的稳定性和pH响应性释放行为的实验设计的示意图；i) 在4 ℃下储存一周之前和之后的M2EV（负染色）和M2EV@CaP（未染色）的代表性TEM图像；j）在4 ℃下储存一周之前和之后M2EV（上）和M2EV@CaP（下）的DLS曲线和平均粒度；k)细胞外囊泡标记蛋白的表达水平；I)在pH 6.0的PBS中孵育不同时间点的M2EV@CaP的代表性TEM图像。m）不同pH条件下M2EV@CaP的粒度分布（左）和平均直径（右）的DLS分析；n）在不同pH值下M2EV@CaP在PBS中的累积Ca2+释放曲线

（2）M2EV@CaP的生物相容性和细胞内转运

图2a的活/死荧光图像显示各组几乎全为绿色活细胞，定量存活率>95%，表明M2EV@CaP无急性毒性；图2b的CCK-8曲线呈时间依赖性上升，7天时与Control、M2EV差异无统计学意义，确认长期增殖活性不受抑制；图2c的共定位分析表明PKH26信号与Lyso-Tracker高度重叠，与Mito-Tracker极少重叠。证实溶酶体为主要转运终点且呈时间依赖性成熟；图2d的TEM低倍可见多处质膜内陷（白色箭头），高倍确认内含电子致密球体（蓝色箭头），提示网格蛋白介导的内吞是主要入口；图2e的EDS面扫显示胞质黑色颗粒Ca、P、O原子比约1:1:4，与无定型磷酸钙特征谱一致，且颗粒周围可见胶原纤维沉积，预示早期生物矿化。综上，M2EV@CaP兼具良好生物相容性与溶酶体依赖的酸响应降解能力，在释放囊泡内容物的同时诱导矿化颗粒形成，为其后续促成骨应用奠定基础。

图2.M2EV@CaP的生物相容性和细胞内转运。a）用不同组处理24小时后BMSC的代表性活/死染色图像（左）（对照、M2 EV和M2EV@CaP）及相应的半定量分析（右）。b）CCK-8测定，评估用各组处理后BMSC的增殖；c)用PKH 26标记的M2EV@CaP或M2 EV（红色）孵育6小时后BMSC的代表性荧光图像；）d) M2EV@CaP在BMSC中的细胞内转运的表性的TEM图像；e）用M2EV@CaP处理的BMSC分泌的电子致密颗粒的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）和元素图谱

（3）M2EV@CaP高糖炎症免疫调节与促成骨

图3a示意HG+LPS模拟糖尿病炎症环境，明确后续实验背景。图3b RT-qPCR显示，与单纯HG+LPS刺激相比，M2EV与M2EV@CaP均显著下调IL-6、CCL2、IL-1β mRNA水平，两组间转录差异无统计学意义，提示基础抗炎基因表达趋势一致。图3c Western blot进一步揭示，M2EV@CaP对NOS2、IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的抑制幅度明显大于M2EV，表明矿化外壳在翻译后水平增强抗炎效力。图3d免疫荧光共标NOS2/CD68显示，M2EV@CaP组NOS2阳性信号面积显著缩小，半定量结果与Western趋势吻合，直观证实其更有效地阻断M1表型。图3e流程图示意成骨诱导实验设计，突出炎症-成骨双重压力。图3f qPCR结果表明，M2EV@CaP处理7 d后BMP2、RUNX2、SP7 mRNA表达量约为对照的2.5–3倍，显著优于M2EV组，提示转录层面成骨程序被充分激活。图3g Western blot显示，对应蛋白水平随基因上调而同步升高，且矿化组增幅最大，说明CaP壳协同EV信号放大成骨蛋白合成。图3h ALP染色7 d呈深紫色，ARS染色14 d出现广泛红褐色钙结节，积分光密度定量分别提高2.8倍与3.4倍，直观反映M2EV@CaP在早期酶活与晚期矿化沉积的双重优势。综上，图3a–3h共同证明M2EV@CaP在糖尿病样炎症环境中兼具抑制M1极化与强力促成骨的双重功能。

图3 M2EV@CaP高糖炎症免疫调节与促成骨。a) 高糖下M2EV@CaP调控巨噬极化示意；b) 12 h炎症基因（IL-6、CCL2、IL-1β）表达；c) 24 h M1蛋白Western与定量；d) NOS2/CD68免疫荧光及半定量；e) 成骨高糖炎症下M2EV@CaP促BMSCs成骨示意；f) 7天成骨基因（BMP2、RUNX2、SP7）表达；g) 7天成骨蛋白Western与定量；h) 7 d ALP与14 d ARS染色及半定量

（4）M2EV@CaP通过Ca 2 +-Akt信号调节BMSC成骨分化

图4a以流程图形式概述研究策略：在HG+LPS模拟的糖尿病炎症环境中，系统解析M2EV@CaP促进BMSCs成骨的分子机制，为转录组测序和信号轴验证奠定框架。图4b火山图直观呈现差异基因分布：与M2EV相比，M2EV@CaP组119个基因显著上调（红色）、119个基因下调（蓝色），差异对称且远离中线，提示CaP外壳显著重塑转录谱。图4c KEGG气泡图进一步指出富集最显著的前10条通路，其中PI3K/Akt、黏附、肌动蛋白骨架及钙信号气泡直径最大、颜色最深，表明其与成骨高度相关。图4d共聚焦Fluo-4 AM显示，M2EV@CaP组胞内绿色荧光强度较Control与M2EV提高约2倍，直观证实游离Ca²⁺水平显著升高；图4e流式定量结果与共聚焦一致，平均荧光强度峰值右移，证明Ca²⁺负载具有群体一致性。图4f免疫荧光中，Phalloidin标记的F-肌动蛋白（红色）与ITGA5（绿色）在M2EV@CaP组丝束粗壮、共定位增多，加入BAPTA后荧光明显减弱，表明Ca²⁺可调控骨架重塑与整合素表达；图4h Western blot量化F/G-actin比值由0.45升至0.82，BAPTA回降至0.50，证实肌动蛋白聚合依赖Ca²⁺。图4i显示p-Akt/Akt比值在M2EV@CaP组升高3.1倍，BAPTA预处理将其降至基线，明确Ca²⁺位于Akt上游；图4j PI3K抑制剂LY294002实验表明，BMP2、OCN蛋白显著下调，证明Akt活性是成骨蛋白表达的必要条件。图4k qPCR同步显示BMP2与RUNX2 mRNA在抑制条件下分别下降60%与55%，与蛋白水平一致，验证转录依赖关系；图4l ALP染色可见M2EV@CaP组蓝紫色最深，LY294002处理后染色明显变浅，积分光密度下降50%，进一步说明PI3K/Akt轴介导早期成骨活性。综上，图4a–4l共同构建“Ca²⁺-Akt-骨架重塑-成骨基因”完整证据链，阐明M2EV@CaP通过释放钙离子激活PI3K/Akt信号，从而增强BMSCs成骨分化的核心机制。

图4 M2EV@CaP通过Ca 2 +-Akt信号调节BMSC成骨分化。a）M2EV@CaP促进BMSC成骨分化的机制的示意图；b）M2EV@CaP和M2 EV组之间差异表达基因的火山图；c）KEGG富集分析，鉴定了M2EV@CaP和M2 EV组之间差异激活的前10个信号通路；d）不同处理3天后BMSC中Fluo-4 AM染色（绿色）的代表性荧光图像和半定量分析；e）不同处理3天后BMSC中Fluo-4 AM荧光的代表性流式细胞术结果和半定量分析；f）F-肌动蛋白的代表性免疫荧光图像（鬼笔环肽，绿色）和ITGA 5（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色；g）不同处理3天后BMSC中ITGA 5表达的Western印迹分析，以及用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM处理的BMSC中ITGA 5和RUNX 2的表达。h）通差异超离心进行不同处理3天后，以及在用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM处理的BMSC中，肌动蛋白的蛋白质印迹分析；i)不同处理3天后BMSC中p-Akt和总Akt表达的蛋白质印迹和半定量热图；j）用或不用M2EV@CaP和BAPTA-AM处理的BMSC中的成骨相关蛋白表达的Western印迹分析；k）成骨标志物的相对mRNA表达水；l）用或不用M2EV@CaP和LY 294002处理的BMSC的代表性ALP染色图像

（5）用于糖尿病大鼠颅骨缺损修复的M2EV@CaP/凝胶复合材料的工程设计和评价

图5a通过流程图展示了整体策略，其将M2EV@CaP均匀分散于GelMA溶液后，经405 nm紫外光交联，从而形成可注射且原位固化的复合水凝胶，并为后续局部递送奠定技术路线。图5b的SEM低倍图像呈现贯通大孔结构，孔径约为100–200 μm，高倍视野可见矿化囊泡紧密贴附孔壁，由此直观证实粒子成功载入且多孔微结构保持完整。图5c利用PKH26共聚焦三维重构显示，红色荧光均匀布满整个凝胶基质，未见聚集或沉降，该结果说明囊泡在三维网络中稳定分散，并可保障长期均匀释放。图5d的元素分布图表明，Ca信号仅出现在M2EV@CaP/gel组，与C、P重叠良好，EDS谱出现Ca-P特征峰，从而定量验证矿化壳完整保留。图5e的压缩力学测试显示，三组应力-应变曲线几乎重叠，Young’s模量约为8 kPa，表明粒子加入未削弱凝胶本体强度，可满足缺损区早期机械需求。图5f的流变结果表明，存储模量G′全程高于损耗模量Gʺ，且随频率平稳上升，呈现典型弹性固体行为，为血管长入和细胞驻留提供稳定支架。图5g通过时间轴展示，高糖高脂联合低剂量STZ诱导糖尿病，血糖高于16.7 mmol·L⁻¹后行双侧5 mm颅骨缺损，随后原位注射材料，并在4周与8周取样，由此形成完整疗效评价周期。图5h的micro-CT 3D重建可见，8周时M2EV@CaP/gel组缺损区几乎闭合，骨桥连续，而对照组仍见明显孔洞，直观展示修复优势。图5i提供的定量分析指出，BV/TV在4周达到37%，8周升至77%，显著高于M2EV/gel的45%，且Tb.N与BMD同步提升，为疗效提供统计学依据；同期组织学HE显示新生骨板成熟，Masson胶原蓝染致密排列，血管区丰富，证实基质重塑与骨成熟度最优。综上，图5a至图5i形成从凝胶制备、力学性能到糖尿病缺损修复的完整证据链，表明M2EV@CaP/gel兼具缓释、力学稳定与免疫-成骨双功能，显著加速临界骨缺损再生。

图5 用于糖尿病大鼠颅骨缺损修复的M2EV@CaP/凝胶复合材料的工程设计和评价。a）通过UV交联制备M2EV@CaP/凝胶的示意图；b）凝胶、M2 EV/凝胶和M2EV@CaP/凝胶在不同放大倍数下的SEM图；c）显示PKH 26标记的M2 EV和M2EV@CaP在水凝胶中的分布的3D共聚焦图像。d）显示C、Ca和P元素在M2 EV/凝胶和M2EV@CaP/凝胶中的分布的元素作图，以及相应的EDS光谱e）来自凝胶、M2 EV/凝胶和M2EV@CaP/凝胶的压缩测试的代表性应力-应变曲线。f）流变学分析，显示水凝胶在不同频率下的储能模量（G′）和损耗模量（G ′）；g）在糖尿病大鼠中建立颅骨骨缺损模型的实验程序的示意图。h）在8周时基于骨体积分数（BV/TV%）和骨小梁数目（Tb.N）的骨再生的定量分析；ii）代表性的显微CT、HE和Masson三色染色图像显示了术后8周时各组（空白、凝胶、M2 EV/凝胶和M2EV@CaP/凝胶）中的骨再生代表性的显微CT、HE和Masson三色染色图

（6）M2巨噬细胞极化和成骨增强糖尿病性骨再生

图6a 流式检测显示，术后10天各组CD86⁺CD11b⁺ M1比例无统计学差异，20天M2EV@CaP/gel降至23.7%，显著低于M2EV/gel的75.9%，表明其随时间推移持续抑制促炎表型。图6b与图6d定量结果指出，4周RUNX2⁺与ALP⁺细胞在M2EV@CaP/gel组分别达到82%与57%，8周OCN⁺与BMP2⁺面积升至70%与60%，均显著高于其余各组，体现成骨-矿化全程优势。图6c与图6d免疫荧光显示，4周缺损内p-Akt⁺CD90⁺细胞数在M2EV@CaP/gel为51，较M2EV/gel的30进一步提升，表明Akt激活是体内促成骨的关键机制。综上，图6a至图6d共同构建“M1→M2极化-Akt激活-成骨基因上调”完整证据链，阐明M2EV@CaP/gel通过免疫-成骨双重调控显著加速糖尿病骨缺损修复。

图6 M2EV@CaP通过M2巨噬细胞极化和成骨增强糖尿病性骨再生。a) ）在植入后10和20天，对颅骨缺损区域中的CD 86 + CD 11b+细胞进行流式细胞术定量。；b）植入后4周时在颅骨缺损区域中RUNX 2（红色）和ALP（绿色）以及在植入后8周后OCN（绿色）和BMP 2（红色的表达免疫荧光染色图像；c)植入后4周时在颅骨缺损区域中RUNX 2（红色）和ALP（绿色）以及植入后8周OCN（绿色）和BMP 2（红色）的表达免疫荧光染色图像；d）免疫荧光结果的半定量分析