针对上述问题，东南大学附属中大医院居胜红教授团队构建了一种 ROS 响应型纳米胶束 IR825@HRG用于共递送光敏剂 IR825 与 TAM 重编程蛋白 HRG；其经静脉注射后可在肿瘤部位富集，经 808 nm 激光触发，IR825 同步产生光热/光动力效应诱导肿瘤细胞免疫原性死亡并释放 DAMPs，激活树突状细胞与 CD8⁺ T 细胞，而激光产生的 ROS 就地解离 TK 键释放 HRG，将 M2-TAM 极化为 M1 表型，把免疫抑制性 TME 转为免疫活跃状态，实现原位瘤高效消融、远端转移抑制及长期免疫记忆，为“冷肿瘤”提供一种可精准时空控制的光-免疫协同治疗新范式。该文章于2025年10月10日以《Spatiotemporally Controlled Nanomicelles for Synergistic Phototherapy and Immune Reprogramming in Triple-Negative Breast Cancer》为题发表于《ACS Nano》上（DOI: 10.1021/acsnano.5c09413）。

研究示意图

（1）通过scRNA-Seq和数据库的TNBC的免疫景观和预后意义

TNBC单细胞测序（图1a）显示肿瘤内免疫细胞总体增多，但构成失衡：巨噬细胞显著富集，树突细胞与T细胞相对缺如（图1b）。TCGA-BRCA队列K-means将TNBC按免疫浸润分为高、中、低三组，对应免疫细胞丰度热图见图1c。CIBERSORT显示TNBC组织内M2型TAMs为优势亚群（图1d）。Kaplan–Meier分析表明M2/M1比值高者总生存显著缩短（图1e），且M2-TAMs比例升高与CD8⁺T细胞呈负相关（图1f、1g）。免疫荧光进一步证实，随病理分期升高，M1/M2比值下降（图1h、1i）。

图1.基于scRNA-Seq和数据库的TNBC的免疫景观和预后意义。(a) TNBC患者新鲜组织的scRNA-seq。(b)通过scRNA-seq数据富集肿瘤组织中的免疫细胞。(c)热图描绘了TCGA-BRCA队列中高、中、低浸润样本中检测到的免疫细胞类型的平均标准化丰度。(d)使用CIBERSORT算法的TCGA-BRCA队列样本中免疫细胞比例的热图。(e)原发肿瘤中根据M2/M1比值的总生存率Kaplan - Meier曲线。(f)Pearson相关检验CD8+T细胞与M2- tam的相关性。(g)原发肿瘤中鉴定的免疫细胞的一致性。(h) I ~ III期TNBC患者(n = 20) M2- tam(CD206)和M1- tam (CD86)免疫荧光染色;(I) TNBC患者各期M1/M2比值的定量统计

（2）IR825@HRG的制备和表征

图2a~b 的TEM显示IR825@HRG纳米胶束呈均匀球形，粒径98.7 ± 21.1 nm（图2a、2b）；ζ电位−18.09 mV，其在DMEM培养基中14天粒径稳定性良好（图2c、2d）。IR825@HRG纳米胶束中IR825的包封率为93.6 %、载药量15.03 %，HRG对应90.71 %、31.67 %。在808 nm激光（1 W cm⁻²）下，200 μg mL⁻¹ IR825@HRG 2 min升温42.3 °C，PBS仅4.8 °C（图2e）；ΔT随功率增强而升高（图2f）。红外热成像显示相同IR825浓度（10 μg mL⁻¹）照射5 min后，IR825@HRG组升温显著高于游离IR825与PBS（图2g），且4次开/关循环温度曲线重合（图2h）。DPBF探针显示ROS生成呈浓度与时间依赖性（图2i~j）。4T1荷瘤小鼠24 h CLSM：IR825@HRG组肿瘤HRG荧光为游离HRG的3.2倍（图2k~l）。

图2.IR825@HRG NMs的形态与表征。(a) IR825@HRG的TEM图像。(b) IR825@HRG的粒径分布。(c) IR825@HRG的Zeta电位。(d) IR825@HRG在DMEM中的长期稳定性。(e)不同IR825浓度和(f)不同功率密度辐照下IR825@ HRG的温度变化曲线。(g) PBS、游离IR825、IR825@HRG溶液辐照后的红外热像图，(h) IR825@HRG、游离IR825溶液经过4次光热加热后的温度变化曲线。(i)不同IR825浓度下808 nm激光照射DPBF与IR825@HRG的吸收光谱;(j)不同照射时间下808 nm激光照射DPBF与IR825@HRG的吸收光谱。(k)注射IR825@HRG后24 h HRG在TNBC肿瘤组织中的积累，(l) alexa647标记的HRG在肿瘤部位积累的荧光强度

（3）体外抗肿瘤疗效和ICD诱导

4T1细胞实验显示，IR825@HRG纳米胶束的胞内荧光强度显著高于游离IR825与PBS组，提示其摄取效率提升（图3a、3b）；图3c~d显示无激光照射时细胞存活率>90%，而808 nm激光（1 W cm⁻²）照射后存活率随IR825浓度（10–200 μg mL⁻¹）递减至约30%，Calcein-AM/PI共染呈现红色荧光（死细胞）占主导且随激光功率增强而增加。ROS探针DCFH-DA显示IR825@HRG+L组绿色荧光强度约为PBS的6倍，且随功率递增（图3e、3f）。ICDM指标同步升高：ATP分泌量达2.8 nmol/10⁶细胞，为PBS的3.5倍（图3g）；HMGB1核外泄率>80%，胞外浓度升高2.9倍（图3h~i）；CRT转位阳性率约75%，显著高于对照（图3j~k），表明激光激活的IR825@HRG可高效产生活性氧并诱导强烈免疫原性细胞死亡。

图3.体外抗肿瘤疗效及ICD效果。(a) 4T1细胞与PBS、自由IR825、IR825 NMs和IR825@HRG NMs孵育6 h的CLSM图像。(b)不同时间点的荧光强度。 (c) 4T1细胞在不同浓度IR825@HRG和激光照射下的细胞活力。(d) 4T1细胞AM和PI活/死染色的CLSM图像。(e)不同处理后4T1细胞DCF强度的CLSM图像和(f)不同处理下的荧光强度。(g)不同处理后4T1细胞内ATP的分泌情况。(h) 4T1细胞内HMGB1红色荧光的CLSM图像和(i)不同处理后细胞外HMGB1的分泌情况。(j) 4T1细胞CRT绿色荧光的CLSM图像。(k)不同处理后的荧光强度

（4）体外抗肿瘤巨噬细胞复极化

图4a显示IL-4刺激48 h后，RAW264.7巨噬细胞呈现典型M2极化形态并高表达CD206（阳性率85.4 %），同时CD86维持基线水平（阳性率9.8 %），确认M2模型建立成功。随后给予不同制剂处理并辅以808 nm激光（1 W cm⁻²，5 min），图4b~c流式细胞术显示IR825@HRG+L组CD86阳性率大幅升至68.2 ± 3.1 %，CD206阳性率降至18.4 ± 2.3 %，对应的M1/M2比值达3.7 ± 0.3，显著高于PBS组（0.12 ± 0.02）、游离HRG组（0.31 ± 0.05）、IR825@HRG无激光组（0.29 ± 0.04）以及IR825+L组（0.68 ± 0.08），差异均具有统计学意义。细胞上清ELISA检测进一步验证功能转换：抗炎因子IL-10浓度由145 ± 9 pg mL⁻¹降至42 ± 5 pg mL⁻¹，促炎因子IL-12浓度由28 ± 4 pg mL⁻¹升至96 ± 7 pg mL⁻¹，变化幅度均优于其余各对照组（图4d、4e）。

图4.体外抗肿瘤巨噬细胞再极化。(a)不同处理后巨噬细胞复极化示意图。(b)流式细胞术分析不同处理后M2样巨噬细胞(CD206)和M1样巨噬细胞(CD86)的比例和(c) M1/M2比值 (d) ELISA分析不同处理后抗炎IL-10和(e) IL-12

（5）对4T1原发性肿瘤的抗肿瘤作用

图5a~b显示静脉注射后，IR825@HRG组肿瘤荧光强度于24 h达峰值，显著高于PBS、游离IR825及IR825 NMs组，图5c~d的离体成像显示肿瘤蓄积量提高约3.2倍；图5e的时间-荧光曲线明确确定24 h为最佳照射窗口。按图5f显示实验以“给药-24 h-照射-间隔2天”三轮方案执行：第0、3、6天尾静脉注射，每次给药后24 h进行808 nm激光（1 W cm⁻²，5 min）。首次照射5 min内IR825@HRG+L组肿瘤温度升至46.1 ± 0.9 °C，显著高于游离IR825+L组（38.4 ± 1.1 °C）与PBS组（<2 °C）（图5h~i）；三轮治疗期间该组肿瘤体积由初始110 mm³降至45 mm³，终末抑制率92 %，优于IR825 NMs+L组（58 %）及游离IR825+HRG+L组（61 %）（图5g、5j~k）；。TUNEL显示IR825@HRG+L组阳性面积占比68 ± 5 %（图5l）。

图5.对4T1原发肿瘤模型的抗肿瘤作用。(a)注射治疗在不同时间点的体内生物分布和(b)肿瘤的定量荧光信号强度。(c)注射后肿瘤和主要器官的离体荧光图像和(d)肿瘤和主要器官的定量荧光信号强度。(e)激光照射PTT和PDT的抗肿瘤作用。(f)评估4T1原发肿瘤模型抗肿瘤效果的治疗方案示意图。(g)各组小鼠肿瘤抑制率。(h) 4T1荷瘤小鼠体内热像图和(i)不同处理后肿瘤温度曲线。(j) 4T1荷瘤小鼠第14天的肿瘤生长情况，(k)肿瘤的相对体积。 (l)不同治疗后所有小鼠的TUNEL染色

（6）4T1荷瘤小鼠中免疫微环境的重塑

图6a示意图显示激光可触发ROS释放HRG，协同ICD将“冷”瘤微环境转为“热”状态，驱动M2→M1极化并激活后续免疫级联。IR825@HRG+L处理后，瘤内F4/80⁺细胞中CD206⁺M2比例由58 %降至18 %，CD86⁺M1由12 %升至51 %，M1/M2比值升至2.8（图6b–e）；免疫荧光显示M2面积减少70 %，M1面积增加4.3倍（图6f~g）。细胞因子检测结果显示IL-10由145 pg mL⁻¹降至43 pg mL⁻¹（降幅70 %，图6h）；IL-12、IL-6、TNF-α分别升高3.2、2.4、2.1倍（图6i）。图6j示意图显示检测范围涵盖肿瘤原发灶及引流淋巴结（TDLN）；图6k–r流式结果显示肿瘤内CD11c⁺、DC中CD80⁺CD86⁺成熟比例由21 %升至64 %，TDLN中由19 %升至71 %（图6k–r）。瘤内CD8⁺CTL浸润率由4.7 %增至28 %（图6s），IHC计数每视野CD8⁺细胞由35个增至180个（图6t、u）。

图6.4T1荷瘤小鼠免疫微环境的重塑。(a) TNBC模型中M2样到M1样巨噬细胞复极化的抗肿瘤免疫反应示意图。(b) M2样细胞(CD206阳性)和(c) M1样(CD86阳性)巨噬细胞。(d) 4T1肿瘤组织中CD206阳性细胞和(e) CD86阳性细胞表达的量化。(f)合并图像中CD206阳性细胞(绿色)、CD86阳性细胞(粉红色)和DAPI标记细胞核(蓝色)的免疫荧光图像 (g)Merge图像中M1/M2(CD86/CD206)比值的荧光强度。h)肿瘤组织中IL-10和(i) IL-12的量化。(j)原发肿瘤和TDLN抗原呈递DC成熟的抗肿瘤免疫反应示意图。(k) CD86和(l) DC成熟标志物CD80在原发肿瘤中的表达流式细胞术。(m)计算CD86阳性细胞和(n)CD80阳性细胞的表达。o)流式细胞术检测CD86和(p) CD80的表达，它们是TDLN中DC成熟的标志。(q) CD86阳性细胞和(r) CD80阳性细胞的计算表达量。(s)CD8+T细胞的流式细胞术(n = 6)。(t)CD8⁺T细胞的免疫组织化学图像和(u)CD8⁺T细胞的计算表达量

（7）在4T1远处肿瘤和肺转移模型中的抗转移功效

图7a为原发4T1模型的建立及给药示意图，具体为第0天接种原发瘤，第7、10、13天给药，第8、11、14天激光照射。图7b–d结果显示，IR825@HRG+L组第21天肺表面转移结节数降至3 ± 2个，仅占PBS组（18 ± 4个）的17%，且最大结节直径<0.5 mm；H&E量化转移灶面积占比5%，显著低于对照组25%。尾静脉Luc-4T1二次接种模型（图7e方案：第12天静注1×10⁵ Luc-4T1细胞）中，图7f~g第21天活体成像示IR825@HRG+L组肺区光子通量2.1×10⁶ p s⁻¹ cm⁻² sr⁻¹，为PBS组（11.7×10⁶）的18%，信号面积减少82%；图7h~i结果显示离体肺平均辐射强度1.4×10⁶ p s⁻¹，不足对照组1/6，且肺重量降低63%。

图7.4T1远处肿瘤和肺转移模型的抗转移疗效。(a) 4T1荷瘤模型中评估远处肿瘤的治疗方案示意图。(b)观察期结束时肺转移性肿瘤结节。(c)肺组织H&E染色及(d)不同治疗后肺内转移性肿瘤结节的计算。(e)肺转移模型治疗方案示意图。(f)肺转移瘤第7、14、21天的体内生物发光成像和(g)肺转移瘤荧光强度定量。(h)肺转移瘤第21天的体外生物发光成像和(i)荧光强度定量