为了解决上述挑战，浙江大学陈鸣宇、Sarun Juengpanich及蔡秀军教授团队开发了一种声敏性（TPEN）包载的靶向癌细胞纳米颗粒（STCNs），用于诱导内源性铜死亡并增强HCC的免疫治疗。STCNs通过叶酸受体介导的内吞作用特异性靶向HCC细胞，并在超声激活下释放TPEN。TPEN作为铜螯合剂，能从超氧化物歧化酶中移除Cu²⁺，增加细胞内Cu²⁺水平，进而通过类芬顿反应产生活性氧并升高Cu⁺水平。这种氧化应激破坏了细胞防御机制，诱导内源性铜死亡，同时产生的ROS激活ICD，刺激树突状细胞成熟和T细胞浸润，从而将HCC免疫抑制性的“冷”肿瘤微环境转化为免疫原性的“热”肿瘤状态。该策略利用STCNs实现时空可控的内源性铜死亡诱导，克服了铜离子载体的局限性，显著提高了HCC的免疫治疗效果。该文章于2025年7月20日以《Targeted Intracellular Copper Reservoir Enhances Liver Cancer Immunotherapy》为题发表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202502783）。

图1. 研究示意图

（1）STCN的合成与表征

NU-1000、NT及TPEN@NT纳米颗粒均呈现纺锤形且尺寸均一（图2a），经SCPLs包覆后形成的STCNs在超声作用下由簇状分布转变为离散颗粒。元素分析证实STCNs中Zr、C、O、N、S均匀分布（图2b）。动态光散射测试表明TPEN@NT包覆后Zeta电位由+38.36 mV降至-36.42 mV，流体力学尺寸由125 nm增至200 nm（图2c-d）。红外光谱在1700 cm^-1和1171 cm^-1处分别检测到C-N键和PEG链特征峰（图2e），X射线衍射证实材料结晶结构稳定（图2f）。稳定性实验显示STCNs在生理环境中4周内保持稳定（图2g）。药物释放测试表明TPEN在超声72小时后释放率达89%（图2i），活性氧检测显示STCNs与TCNs均具有显著的声动力活性（图2j-k）。

图2 STCNs的表征。（a）NT、TPEN@NT和STCNs在有无超声照射下的透射电子显微镜（TEM）图像；（b）STCNs的成像及能量色散谱（EDS）映射；（c）NT、TPEN@NT和STCNs的ζ电位；（d）NT、TPEN@NT和STCNs的粒径分布；（e）SCPLs、NT、TPEN@NT和STCNs的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析；（f）NU-1000、NT、TPEN@NT和STCNs的X射线衍射谱；（g）STCNs在PBS中的稳定性测试，指定时间间隔（0、7、14、21、28天）的粒径分布；（h）STCNs在有无超声照射下的TCPP荧光强度；（i）STCNs的体外药物释放曲线；（j）STCNs在超声照射下的DPBF吸光度谱变化；（k）STCNs/TCNs在超声照射下的相对DPBF峰吸光度

（2）STCN的细胞摄取和细胞毒性

STCNs在肝细胞癌（HCC）细胞HuH-7和Hepl-6中的摄取情况，结果表明STCNs在细胞内的浓度随时间增加，在24小时达到峰值（图3a）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，肿瘤细胞内的STCNs逐渐积累在细胞质中（图3b）。在超声照射下，STCNs在HCC细胞系中的细胞毒性显著高于正常肝细胞AML-12（图3c）。STCNs与US联用时，对Hep1-6和HuH-7细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低，表明其抗肿瘤作用的协同效应（图3d）。STCNs组在超声照射下表现出显著的抗肿瘤效果，而SCNs组未显示明显的增殖抑制（图3e）。此外，STCNs在其他肿瘤模型中也显示出良好的细胞毒性，表明其在临床应用中的潜力（图3f）。

图3 STCNs与HCC细胞的相互作用及抗肿瘤活性。（a）不同时间点Hep1-6或HuH-7细胞对STCNs的摄取荧光图像；（b）不同时间点Hep1-6或HuH-7细胞对STCNs的冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）图像（红箭头指示STCNs）；（c）不同浓度TPEN或STCNs处理48小时后Hep1-6或HuH-7细胞的CCK-8实验结果；（d）不同浓度SCNs或超声照射5分钟下的SCNs处理48小时后Hep1-6或HuH-7细胞的CCK-8实验结果；（e）正常培养基、TPEN、SCNs或STCNs在有无超声照射下处理48小时后Hep1-6或HuH-7细胞的CCK-8实验结果；（f）正常培养基、TPEN、SCNs或STCNs在有无超声照射下处理48小时后NOZ或PNAC细胞的CCK-8实验结果

（3）STCNs内源性铜中毒机制及ICD效应

TPEN释放后，与Cu²⁺结合，失活SOD，并激活Fenton样反应，产生ROS和Cu+，消耗细胞内抗氧化系统，导致脂酰化DLAT形成不溶性复合物，阻断线粒体功能，诱导细胞死亡。STCNs联合US照射可降低GSH水平，促进铜死亡，并激活抗肿瘤免疫（图4a）。STCNs与US联合应用显著降低了SOD活性、Cu水平，并消耗了GSH，且TPEN等效剂量下的SOD活性和Cu水平显著低于STCNs+US组（图4b）。STCNs+US处理显著降低了肿瘤细胞的FDX1表达和DLAT脂酰化，修复了线粒体功能，并诱导了细胞形态变化（图4c）。RNA测序显示，STCNs+US处理与对照组相比，基因表达存在差异，特别是与免疫应答相关的基因上调，表明STCNs+US能够激活抗肿瘤免疫（图4d）。STCNs+US处理显著增加了促使抗原呈递、促进免疫反应的DAMPs（包括CRT、HMGB1、ATP）水平，并提高了CD86和CD80的表达，表明STCNs+US能够促进树突状细胞（DCs）成熟，激活免疫系统，有效消除肿瘤（图4e）。

图4 STCNs诱导内源性铜死亡和免疫原性细胞死亡的评估。（a）STCNs诱导内源性铜死亡机制的示意图；（b）Hep1-6细胞在不同处理条件下的超氧化物歧化酶（SOD）活性；（c）Hep1-6细胞中铜的相对水平；（d）Hep1-6细胞中谷胱甘肽（GSH）的相对水平；（e）Hep1-6细胞中OLI-DLAT、DLAT、β-Actin和FDX1的Western blot结果；（f）Hep1-6细胞内活性氧（ROS）的观察；（g）Hep1-6细胞中ROS的相对值；（h）Hep1-6细胞中CRT和HMGB1的免疫荧光图像；（i）Hep1-6细胞中细胞外ATP水平的测定；（j）ICD触发树突状细胞成熟的示意图

（4）STCN的疗效评价及免疫应答激活

TCNs联合超声治疗组（17.5 mg/kg，1.0 W/cm²超声）显著抑制皮下HCC小鼠肿瘤生长，肿瘤体积最小（图5a-c）；该组中位生存期延长至74天（PBS组38天），且未引起明显体重异常（图5d）。免疫荧光显示STCNs+US显著激活肿瘤免疫微环境（图5e）。联合PD-1抑制剂后，肿瘤体积进一步减小，协同增效作用显著（图5f-g）。

图5 STCNs的治疗效果及免疫反应激活评估。（a）治疗效果评估的实验流程示意图；（b）不同组别在皮下HCC模型治疗期间的肿瘤体积变化；（c）治疗21天后不同组别的肿瘤图像；（d）不同组别小鼠皮下HCC模型的生存曲线；（e）不同处理后肿瘤组织中CD45+细胞和CD8+ T细胞的荧光图像；（f）结合STCNs与α-PD1的治疗效果评估示意图；（g）不同组别在皮下HCC模型治疗期间的肿瘤体积变化

（5）STCN的肿瘤靶向能力、生物分布和生物安全性

STCNs在注射后不同时间点（1, 4, 8, 12, 24, 36 h）的体内荧光成像，显示STCNs在肿瘤部位的滞留能力和靶向能力，以及在肝脏、肾脏和肿瘤中的主要分布（图6a）；STCNs治疗40天后，与健康小鼠相比，血细胞参数无显著变化（图6b）；STCNs治疗40天后，肝功能检测结果无显著变化（图6c）；STCNs治疗40天后，主要器官（肾脏、脾脏、肺、心脏、肝脏）的H&E染色切片未显示明显异常（图6d）。

图6 STCNs的肿瘤靶向能力、生物分布和生物安全性。（a）不同时间点从小鼠收集的肿瘤及其他器官的荧光图像；（b）健康小鼠每周静脉注射30天后进行血液学分析；（c）健康小鼠每周静脉注射30天后进行血液生化分析；（d）STCNs体内毒理学的H&E染色分析