针对上述问题，上海交通大学霍云龙教授团队设计的LNP - mRNA系统在体内生成的瞬时FAP靶向CAR - T（FAPCAR - T）细胞的治疗活性，并探索在博莱霉素（BLM）诱导的肺纤维化小鼠模型中的肺再生机制。该团队开发了一种新型LNP-mRNA系统，并在博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化小鼠模型中验证了其肺再生机制。研究假设认为，持续的纤维化积聚会通过支持炎症环境和改变细胞形态，导致细胞外基质（ECM）硬化并阻碍肺部再生。为验证该假说，该团队对BLM诱导肺纤维化的年轻/老年小鼠模型进行了蛋白质组学和单细胞测序（scRNA-seq）的全面分析。结果显示，ECM硬化会抑制II型肺泡上皮细胞（AT2）向I型肺泡上皮细胞（AT1）的分化，从而损害肺泡结构的自我修复能力。LNP-mRNA疗法不仅消除了肺纤维化，还通过改善ECM环境增强了AT2和Pclaf+细胞的可塑性，成功挽救了AT1细胞群。此外，肺部免疫功能通过Apoe+巨噬细胞重建，并伴随效应T细胞数量的增加而恢复。总体而言，优化后的LNP-mRNA系统在体内成功生成FAPCAR-T细胞，清除肺纤维化病灶，并促进肺部修。该文章于2025年4月21日以《Targeted immunotherapy rescues pulmonary fibrosis by reducing activated fibroblasts and regulating alveolar cell profile》为题发表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-59093-7）。

图1. LNP-mRNA治疗肺纤维化及相关机制

（1）通过CD5/βLNP-mRNA系统产生的FAPCAR-T细胞

通过用等量的β-谷甾醇替换胆固醇来提高转染效率（图2A）。先前的研究提出，β-谷甾醇可以促进脂质颗粒的内质网逃逸。不同比例的β-谷甾醇与LNP（0-40%）对LNP的物理特性影响不大。测试了在不同β-谷甾醇浓度下，经过24小时孵育后，293T细胞、成纤维细胞和正常肝细胞中荧光素酶mRNA的表达。含有30% β-谷甾醇和10%胆固醇的LNP表现出最高的mRNA表达，并被定义为βLNP。透射电子显微镜（TEM）扫描显示，βLNP和CD5修饰的βLNP（CD5/βLNP）之间没有显著差异，两者都具有约4纳米的双层膜和含有密集核苷酸的核心区域（图2B）。

体外转录（IVT）mRNA包含5'帽子结构、优化的UTR结构域、Kozak序列、修饰的poly(A)尾和编码CAR序列的ORF结构域（图2C）。除了传统的带有CD28跨膜结构域（TMD）的CAR设计外，还引入了一种新的TMD设计，遵循可编程膜蛋白（proMP）策略。先前的研究表明，来自CD28的跨膜片段有可能招募额外的共刺激信号，这可能导致CAR-T细胞的过度激活。这种效应在癌症治疗中可能是有益的，但在非肿瘤应用中可能导致不必要的细胞激活和细胞因子释放。成纤维细胞激活蛋白（FAP）是激活成纤维细胞的标志物。在博莱霉素给药后14天和28天，检测到肺组织中FAP的高表达（图2D）。基于这些发现，设计了两种FAP靶向CAR序列，分别带有CD28 TMD（FAPCAR 2.1）和优化的TMD（FAPCAR 2.2）。

经过24小时共孵育后，CD5/βLNP-mRNA与原代小鼠T细胞的FAPCAR 2.1/2.2在T细胞膜上的表达率约为80%（图2E）。细胞毒性实验表明，与仅表达FAP的靶细胞共培养时，瞬时FAPCAR-T细胞的溶解能力取决于效应细胞与靶细胞的比例（E:T）（图2F）。此外，与CD5/βLNP-FAPCAR 2.1相比，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2导致细胞因子释放减少了约30%，而没有改变溶解能力（图2G），表明优化的TMD的优越性，使其更适合用于肺纤维化。此外，CD5/βLNP主要在脾脏和肝脏中累积，而IgG/βLNP仅在肝脏中累积，这表明CD5/βLNP具有靶向脾脏的能力（图2H）。为了进一步验证这一点，在注射后24小时对小鼠的脾脏进行了分析，发现CD5/βLNP主要与T细胞（CD3e阳性）共定位，很少与B细胞（CD19阳性）或树突状细胞（DCs，CD11c阳性）共定位。此外，部分CD5/βLNP与F4/80阳性巨噬细胞共定位，这表明外源性LNP被巨噬细胞吞噬（图2I，S2D）。随后，对小鼠进行了不同剂量的荧光素酶mRNA表达分析。在脾脏和肝脏中，注射量越大，表达量越高；然而，这些器官中的表达在96小时后被系统性清除（图2J，S2E）。然后，通过流式细胞术分析了FAPCAR mRNA在体内的转染情况。结果显示，在注射10μg的CD5/βLNP-FAPCAR后24小时，约3%的原代T细胞被编程为FAPCAR-T细胞，这比生理盐水注射组显著增加（图2K）。CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗在体内成功生成了FAPCAR-T细胞。

图2. A.传统和β-谷甾醇修饰的靶向LNP（βLNP）结构示意图。B. βLNP和带有CD5表面修饰的βLNP（STEM图像）的膜结构。C. FAPCAR 2.1和FAPCAR 2.2 IVT mRNA示意图。优化的TMD替换了FAPCAR 2.2序列中的CD28 TMD。D. 博莱霉素建模后0、14和28天小鼠肺中FAP的IHC染色。箭头：FAP阳性过度激活的成纤维细胞。E. 经过24小时与IgG/βLNP或CD5/βLNP共孵育后，小鼠T细胞表面FAPCAR 2.1和FAPCAR 2.2受体的表达。F. 经过36小时共培养后，瞬时CAR-T与3T3细胞的靶向溶解实验。G. 经过48小时共培养后，FAPCAR-T与FAP-3T3细胞的细胞因子产生（效应细胞：靶细胞比例=10:1）。 H. 注射后24小时，用PKH26标记的βLNP在小鼠脾脏和肝脏中的分布。I. 注射后24小时，脾脏中CD5/βLNP（红色）与CD3e阳性T细胞（绿色）的共定位。J. 不同剂量下，βLNP在小鼠体内转染后荧光素酶mRNA的剂量和时间依赖性分布和表达变化。K. 与生理盐水注射相比，注射10微克CD5/βLNP后24小时，通过流式细胞术检测FAPCAR 2.1和2.2 mRNA的表达

（2）CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗逆转肺纤维化

通过CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗成功在体内生成了FAPCAR-T细胞。随后在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中评估了其抗纤维化反应。博莱霉素模型的小鼠分别接受CD5/βLNP-FAPCAR 2.2、IgG/βLNP-FAPCAR 2.2或生理盐水处理。治疗组还在术后第7天和第14天接受了商业基准药物吡非尼酮（PFD，100 mg/kg/天）的口服给药（图3A）。苏木精-伊红染色显示，从术后第7天起肺纤维化和肺泡异常开始出现，并随着纤维化的进展逐渐加重（图S3A）。CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，小鼠体重和肺系数迅速恢复，存活率在所有接受博莱霉素手术的组中最高（图3B–D）。在CD5/βLNP组（而不是在生理盐水或PFD组）中，在术后第15天观察到CD3+T细胞的积累（图S3B）。为了观察转染情况，在FAPCAR mRNA中生成了tdTomato报告基因。在脾脏和纤维化的肺部，可检测到共表达CD3和tdTomato的T细胞（图3E），这为CD5/βLNP转染和FAPCAR-T细胞浸润纤维化肺组织提供了证据。此外，流式细胞术显示，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，小鼠脾脏和肺部的FAPCAR阳性T细胞数量增加（图3F，S3C，D），而IgG/βLNP治疗或健康小鼠中则没有。重要的是，CD5/βLNP组的FAP阳性成纤维细胞数量显著减少，而PFD治疗对这一指标没有影响（图3G，S3E）。根据肺纤维化评估的标准指南，术后第28天对动物进行微计算机断层扫描（CT）分析。影像学结果表明，博莱霉素+生理盐水组在肺部区域出现区域实变和弥漫性阴影，肺部的Hounsfield单位（HU）密度增加，而这些症状在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后显著缓解（图3H）。重建的3D肺模型显示，治疗后纤维化组织（红色区域）显著减少，肺部空气量增加，表明功能恢复（图3I，S3F）。然后对肺部进行充分灌注后收集。整个肺部外观图像显示，纤维化肺部因组织损伤导致间质红细胞渗漏，出现红色病变，而健康组和CD5/βLNP治疗组的肺部呈白色（图3J）。

图3. A.年轻或老年小鼠纤维化模型建立及治疗策略示意图。B，C.年轻小鼠体重变化(B)及存活曲线(C)。D. 肺部指数。E.第二次注射CD5/βLNP-FAPCAR 2.2后24小时脾肺T细胞中tdTomato报告基因表达情况。F. 流式细胞术检测小鼠CD3+肺T细胞的表达比值。G. 流式细胞术分析小鼠肺部FAP+Pdgfra+成纤维细胞比例。H. 术后第28天的数字照片。I. CT图像和根据CT结果计算的肺部空气量和 J. 肺组织照片

（3）老年小鼠的抗纤维化反应

通过Masson和Picrosirius红染色评估显示，与生理盐水、IgG/βLNP或PFD组相比，CD5/βLNP治疗组的细胞外基质纤维化显著改善（图4A–C）。此外，羟脯氨酸（HYP）测定显示，经CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，胶原蛋白含量接近健康水平（图4D）。机械测试评估显示，经CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，全肺组织的弹性模量显著降低（图4E）。总之，注射CD5/βLNP-FAPCAR 2.2显著减少了FAP阳性细胞数量，并拯救了肺纤维化，而PFD治疗对纤维化的缓解效果有限，这可能是因为治疗时间较短。

特发性肺纤维化（IPF）的发病率与年龄呈正相关，且在老年人群中更为普遍。为了进一步验证CD5/βLNP-FAPCAR 2.2在抑制肺纤维化中的作用，在16月龄的老年小鼠中建立了纤维化模型。与年轻小鼠相比，老年小鼠在接受相同剂量的博莱霉素后，博莱霉素诱导的肺纤维化更为严重，表现为更大的区域实变面积、更高的Hounsfield单位（HU）密度以及更少的肺部空气量（图4I-K）。在接受CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，与博莱霉素+生理盐水和IgG/βLNP组相比，老年小鼠的生存率显著提高，肺系数降低，尽管老年小鼠的体重恢复速度不如年轻小鼠快（图4F-H）。Masson染色和羟脯氨酸（HYP）定量显示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，老年小鼠的纤维化和胶原蛋白含量显著降低（图4L，M）。这些结果表明，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2疗法可以抑制老年小鼠的肺纤维化。

图4. A. Masson和Picrosirius红染色显示纤维化区域。B. 纤维化区域定量分析。 C. Ashcroft评分定量分析。D. 羟脯氨酸（HYP）测定用于定量胶原蛋白含量。E. 使用机械测试系统评估全肺组织的弹性模量。F. 老年小鼠体重变化。G. 老年小鼠存活率。H. 老年小鼠肺系数。I. 小鼠肺部照片。J，K. 微计算机断层扫描（CT）图像 。L. Masson染色定量分析纤维化区域。M. 羟脯氨酸（HYP）测定用于定量胶原蛋白含量

（4）纤维化肺中蛋白质的特征

对博莱霉素给药后0、14和28天的三个时间点进行了蛋白质组学分析（每组4只小鼠），结果显示BLM小鼠随时间推移蛋白质组发生了显著变化（图5A）。K-means聚类算法将所有组的4126个差异表达蛋白（DEPs）分为6个簇，这与热图结果一致。基于GOBP分析，簇被注释为DNA修复、免疫系统过程、细胞外基质（ECM）组织、细胞内信号转导、蛋白质运输和脂质代谢过程（图5B）。特别是，第3簇以ECM蛋白表达的持续增加为特征，这涉及到胶原蛋白和纤维连接蛋白表达的上调（例如，Fn1、Fbln1、Col4a2、Col18a1）在BLM给药后（图5C，D）。对因CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗而恢复的肺与纤维化肺之间的蛋白质组学分析表明（每组4只小鼠），PCA揭示了BLM+生理盐水组和CD5/βLNP组之间DEPs的显著差异（图5E）。由CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗下调的顶级DEPs富集在ECM、炎症和免疫调节中（图5F），例如下调的ECM相关蛋白（Lox、Ctsd和Ctsz）和上调的抗炎蛋白（Prx、Hpdg和Ifitm3）。这些结果表明，通过使用CD5/βLNP-FAPCAR 2.2，促进了抑制炎症环境和ECM重塑过程。

图5. A. 对纤维化组织进行蛋白质组学策略和PCA分析。B. 通过K-means算法获得的蛋白质簇，并在热图中显示，其中4126个差异表达蛋白被富集到6个簇中。基于GOBP分析对簇进行注释。C. 点图显示了第3簇中富集的顶级10个GOBP术语。D. 显示了博莱霉素给药后0、14和28天的ECM相关蛋白。E. 对治疗的BLM小鼠进行蛋白质组学策略和PCA分析。F. 点图显示了与图（E）对应的下调DEPs富集的顶级5个GOBP、GOCC和GOMF术语。G. 治疗前后纤维化清除和ECM僵硬度调节的示意图。H. 代表性免疫荧光图像（红色：KRT8；绿色：Sftpc；蓝色：DAPI）。I. 点图显示了与图（E）对应的上调DEPs富集的GO术语。J. 上皮极化途径的网络投影图。K. 代表性免疫荧光图像显示极化因子Cdc42和Pkcz（红色：Cdc42；绿色：Pkcz；蓝色：DAPI）在细胞中的位置。L. 代表性免疫荧光图像显示调节上皮极化的关键分子（蓝色：DAPI；红色：Calponin；绿色：Pkcz；白色：Cldn5）。M. 与血管生成（Vegfa、Eng）和二氧化碳调节（Ca4、Ca13）相关的蛋白质相对丰度

（5）抗纤维化治疗后肺泡上皮极化

蛋白质组学分析显示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，细胞外基质（ECM）中的纤维化被清除。机械测试评估显示，治疗后肺组织的弹性模量显著降低（图4E）。这些发现表明，细胞外组织张力降低（图5G），有助于AT2向AT1的分化。此外，免疫荧光结果显示，在治疗后PATS的数量显著减少（图5H），表明AT2向AT1的分化已恢复正常。AT2向AT1细胞的分化与细胞形状和结构的显著变化相关，通常被认为是上皮极化过程。这种转变通常伴随着信号和结构蛋白表达的许多变化。在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，上调的DEPs主要富集在细胞骨架和细胞间连接信号通路中，所有这些都与细胞极化相关（图5I），因此，根据KEGG分析绘制了极化分子图（图5J）。上皮细胞被认为是肺恢复途径富集的关键贡献者。

为了验证这一假设，需要排除巨噬细胞极化或上皮-间充质转化（EMT）过程，因为这两种过程可能在疾病进展过程中发生。通过蛋白印迹分析了EMT标记物的表达（图6A）。从上皮细胞转化而来的间充质细胞表达低水平的E-钙粘蛋白（一种粘附因子）和高水平的波形蛋白。这些标记物的表达在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后接近正常水平。因此，治疗抑制了EMT，并且没有对极化信号富集做出贡献。另一方面，在蛋白质组学数据中，与巨噬细胞相关的富集基因在治疗后减少（图6B）。与基因表达的减少一致，流式细胞术结果显示，在炎症性纤维化肺中，标记为F4/80的巨噬细胞数量增加，而在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后减少（图6C）。亚型分析显示，治疗减少了被鉴定为促纤维化表型的M2巨噬细胞的数量（图6D，E）。总体而言，巨噬细胞总数和M2亚型的减少排除了CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后巨噬细胞极化对途径富集的贡献。

对于上皮细胞极化，由Cdc42和aPKC（Pkc-zeta）形成的信号轴被认为是调节极化的关键。ECM信号通过Crb3感知并传递，Crb3招募Cdc42-aPKC-PAR6在顶膜区域形成复合体。这个复合体是将蛋白质从顶膜区域排除的关键步骤，通过调节细胞骨架，促进蛋白质在顶膜、侧膜和基底膜之间的极化分布。为了验证这一机制，通过蛋白印迹检测了Cdc42的表达水平。在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，肺组织中Cdc42的表达增加（图6A）。此外，免疫荧光结果显示，Cdc42和PKCz在细胞膜上共定位，并且这种共定位倾向于在细胞膜的一侧而不是均匀分布在细胞膜上（图6F，G）。细胞骨架相关的紧密连接得到增强（图6H）。此外，血管生成标记物（Eng，Vegfa）和二氧化碳转运蛋白（Ca4，Ca13）的上调（图6I）表明，蛋白质极化的增加驱动了受损结构和功能的BLM肺在清除过度激活的成纤维细胞后通过FAPCAR 2.2 T细胞的自我修复。

图6. A. 蛋白印迹图像和EMT标记基因以及Cdc42蛋白表达的定量。B. 巨噬细胞标记物的蛋白质组学热图。C. 流式细胞术分析显示肺细胞中巨噬细胞的百分比。D. 流式细胞术图显示M1/M2表型在BLM+生理盐水和CD5/βLNP组之间的比较。E. 代表性免疫荧光图像显示肺组织中的巨噬细胞。（青色：F4/80；红色：iNOS；绿色：CD163；白色：DAPI）。F，G. 代表性免疫荧光图像显示极化因子Cdc42和Pkcz（红色：Cdc42；绿色：Pkcz；白色：DAPI）在细胞中的位置。H. 代表性免疫荧光图像显示调节上皮极化的关键分子。（蓝色：DAPI；红色：Calponin；绿色：Pkcz；白色：Cldn5）。I. 与血管生成（Vegfa，Eng）和二氧化碳调节（Ca4，Ca13）相关的蛋白质相对丰度

（6）肺再生的细胞特征

蛋白质组学结果表明，蛋白通路富集在细胞外基质重塑和上皮极化中，暗示多种细胞类型可能参与信号调节。为了探索成功清除纤维化后的肺再生过程，通过10×Genomics平台对BLM+生理盐水和CD5/βLNP组的肺进行了单细胞测序分析（图7A）。通过建立的细胞标记物对捕获的细胞进行无偏分类和鉴定，将47,129个细胞分为21个簇。发现大多数细胞属于免疫系统，包括T细胞（CD3e+）、NK细胞（Nkg7+）、B细胞（CD79a+）和免疫单核细胞（Cst3+）。此外，还鉴定出几个小群体为肺实质细胞，包括肺泡细胞（Sftp+）、内皮细胞（Pecam+）和成纤维细胞（Dcn+）（图7B）。与BLM组相比，CD5/βLNP组中肺泡细胞、成纤维细胞、T细胞和巨噬细胞的数量发生了显著变化，表明CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗调节了细胞特征（图7C，D）。

成纤维细胞分为三个不同的簇，包括炎症性、纤维化性和间皮细胞，这与最近的研究一致。簇0被鉴定为炎症性成纤维细胞，其高表达Cxcl12和Cxcl13。纤维化性成纤维细胞以Fbln2和其他病理性的细胞外基质基因特征。值得注意的是，两个过表达Col1a1和Col3a1的簇在治疗后显著减少。此外，间皮性成纤维细胞以Msln为特征，在所有组中均保持不变（图7E，F）。此外，FAP在纤维化性和炎症性簇中均有表达。这两个簇中的大多数细胞在BLM组中被发现，表明FAPCAR-T细胞有效地清除了目标细胞，而没有影响其他细胞群。

肺泡细胞是肺再生的关键因素（图7H）。AT1细胞被分为两个簇，即“AT1”，其Ager表达水平较高，以及“Hopxhigh AT1”，其Hopx表达特异性较高。Hopx参与早期发育和分化途径。就这个簇中的Krt8表达而言，Hopxhigh AT1被认为是一种中间状态。此外，簇2被鉴定为PATS，其高表达Krt8和Sftpc。Cxcl2+细胞群的特征是高表达与炎症、纤维化和脂质代谢相关的基因。这个簇在治疗后几乎消失，表明这些细胞可能是高度炎症性损伤细胞，这些细胞在肺纤维化发展过程中暂时出现（图7I-K）。上述所有被鉴定为中间状态或与炎症相关的簇在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后减少，与蛋白质组学分析一致（图7I）。重要的是，在整个肺细胞的UMAP中鉴定出簇12为增殖性肺泡祖细胞（PAPCs）（图7B），这是一个与肺泡细胞相关的显著增加的簇。这一群体以Pclaf、Mki67和Top2a的特异性表达为特征（图7L）。先前的研究强调，PAPCs在肺泡细胞系可塑性中发挥关键作用，作为祖细胞库，并且对于肺再生是必不可少的。为了验证PAPCs的功能，重新聚类PAPCs与肺泡细胞（图7M），并使用RNA速度和Slingshot进行细胞系轨迹推断。PAPCs的发育轨迹被发现朝向肺泡细胞（图7N）。此外，AT1细胞是AT2、Hopxhigh AT1和PATS簇分化的终点。这些结果表明，在肺恢复过程中，肺泡细胞系可塑性增加，AT2或PAPCs在分化为AT1细胞中发挥了积极作用。

图7.A.小鼠肺单细胞测序研究设计。B. 细胞簇的UMAP图和对部分捕获的肺细胞的注释。C. 比较BLM+生理盐水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2组的簇成分。D. 显示显著变化的簇的样本分布。E. 成纤维细胞簇的UMAP嵌入。F. 比较BLM+生理盐水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2组的成纤维细胞细胞簇。G. 在UMAP上表达纤维化和过度激活的成纤维细胞标记基因的表达投影。H，I. 肺泡细胞的UMAP图和注释（H）以及比较BLM+生理盐水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2组的簇状态（I）。J. 每个肺泡细胞簇的代表性标记物的点图。K. 在整个肺细胞簇上表达特定肺泡上皮细胞标记物的表达投影。L， M. PAPCs标记基因在整个肺细胞簇中的表达（L）以及在与肺泡细胞重新聚类的UMAP图中突出显示PAPCs标记基因（M）。PAPCs：增殖性肺泡祖细胞。N. RNA速度分析包括肺泡细胞和PAPCs的簇

（7）Apoe+巨噬细胞和T细胞类型对肺免疫重建至关重要

除了结构恢复外，免疫重建也是器官再生的重要步骤。分析了巨噬细胞和T细胞。首先，巨噬细胞被分为10个簇，其中4个簇（簇2、4、5、7）在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后显著减少，而3个簇（簇0、3、8）增加。簇0、1、2、4、5和6富含肺泡巨噬细胞（AM）标记物（Ear1、Ear2、Chil3、Plet1）（图8A-C）。其余簇为单核细胞来源的巨噬细胞（mono-M），表达Ccr5、CD33、Sell和Itgam。簇2、4和5被鉴定为促纤维化的脂质相关巨噬细胞（LAMs），因为它们高表达促纤维化基因（Fn1、Spp1、CD44）和脂质代谢基因（Lpl、Trem2、Fabp4、Fabp5）。簇7和9表达炎症基因（Il1b、S100a9、S100a8）和典型的骨髓标记基因（CD33），表明它们的单核细胞谱系（图8C）。簇7也参与促纤维化过程。减少的巨噬细胞（簇2、4、5、7）表明，FAPCAR-T细胞通过清除过度激活的成纤维细胞，打破了炎症-纤维化循环，这与流式细胞术和蛋白质组学结果一致。

由于ApoE是一种分泌蛋白，评估了细胞间通讯。CellphoneDB分析显示肺泡巨噬细胞与ApoE+巨噬细胞之间存在强烈的相互作用（图8D）。Trem2已被报道为触发髓系细胞分化和发育的受体。蛋白质相互作用分析显示，ApoE和Trem2配体对仅出现在簇1/3组中（图8E）。这些发现表明，ApoE+巨噬细胞可能有助于刺激髓系细胞的分化和发育。为了进一步确认这一发现，伪时间分析显示，表达高单核细胞标记物的簇作为根细胞，巨噬细胞通过中间簇3分化为产生成熟的先天免疫细胞或成熟的肺泡巨噬细胞（图8F）。相应地，RNA速度分析显示了从ApoE+单核细胞到AM簇的发展路径（图8G）。总体而言，与纤维化相关的肺泡巨噬细胞在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后显著减少，而ApoE+单核细胞群体参与了肺泡巨噬细胞数量的定量补充，以维持其表型用于免疫重建。

对于T细胞，簇7-9被鉴定为成熟的效应细胞群体（Tc1和Th1）和CD4+记忆T细胞（Tm），通过标记基因进行注释。重新聚类显示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗后，这3个簇的细胞数量显著增加。幼稚T细胞（Tn，簇0、1、6）被鉴定为Lef1、Ccr7和Sell的特征，并且在BLM组中更为丰富（图8H-J）。KEGG富集显示，Tn细胞富含Jak-Stat通路和干细胞分化，而效应细胞群体富含Rap1信号通路、细胞因子释放通路和TCR激活通路（图8K）。基于伪时间、Slingshot和RNA速度，Tn细胞可以被分类为干细胞。这些分析进一步揭示了Tn细胞的不同发育轨迹：分化为高表达Ifng和Gzma的群体，或分化为Th17和γδ T细胞（图8L-N）。此外，Ly6a（TCR依赖性激活的标记）在Th1细胞中高表达。这些结果表明，由于CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治疗在纤维化肺中招募了瞬时FAPCAR-T细胞，导致大量效应细胞在肺组织中积累。值得注意的是，这种治疗导致了记忆T细胞新簇的出现，而在BLM组中完全缺失（图8I）。

图8. A. 重新聚类的巨噬细胞簇的UMAP图。B. 不同簇中的细胞百分比。 C. 肺泡、纤维化和脂质相关巨噬细胞的标记基因的突出显示。 D. 使用CellphoneDB分析巨噬细胞簇对之间的相互作用。 E. 簇1/3通讯中显著变化的配体-受体对。P值由Bimod测试确定。 F，G. 伪时间（F）和RNA速度（G）分析ApoE+单核细胞的发育速率。 H，I. 重新聚类的T细胞簇的UMAP图：簇注释（H）和两组（BLM+生理盐水与BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2）之间的比较（I）。J. 比较BLM+生理盐水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2组的T细胞簇。K. T细胞簇的KEGG富集分析。L，M. 伪时间（L）和Slingshot（M）分析Tn细胞的分化轨迹。N. T细胞簇中诱导型T细胞共刺激因子（Icos）和白细胞介素-17a（Il17a）的表达水平，随着发育轨迹的增加而增加。（AM：肺泡巨噬细胞；Mono-M：单核细胞衍生的巨噬细胞；Tn：幼稚T细胞；DNT：双阴性T细胞；Tm：记忆T细胞；Tc：细胞毒性T细胞；Th：辅助T细胞；Treg：调节性T细胞）