为了解决上述问题，北京大学周方和北京航空航天大学刘海峰联合团队以聚多巴胺包被氧化铈纳米颗粒负载镁离子，嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶，构建可光交联的多功能支架。该复合体系兼具抗氧化、抗炎、促成骨与促血管生成能力，系统验证体外细胞相容性及生物活性后，在骨质疏松大鼠颅骨缺损模型中证实其显著加速骨再生，为骨质疏松骨缺损修复提供新策略。该文章于2025年8月28日以《Multifunctional Nanoparticle Reinforced GelMA Hydrogel for Osteoporotic Pathophysiological Microenvironment Improvement and Bone Defect Regeneration》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202505063）。

图1 PDA@CeO₂-Mg纳米复合材料的制备示意图及体内外实验步骤。A）PDA@CeO₂-Mg复合纳米粒子的合成。B）GelMA(PDA@CeO₂-Mg)纳米复合水凝胶的免疫诱导、成骨和血管生成特性。C）GelMA(PDA@CeO₂-Mg)纳米复合水凝胶的体内骨修复能力

（1）不同纳米粒子和纳米复合水凝胶的合成与表征

合成的C、CP及CPM纳米颗粒经SEM和TEM观察均呈现规则形貌与均一粒径分布，CeO₂颗粒表面可见一层薄膜包覆（图2A、B）。FTIR分析显示，CP和CPM在1610 cm^-1处出现C ═ C伸缩振动与N-H弯曲振动特征峰，证明PDA成功修饰于CeO₂表面；在CPM中，还观察到≈500 cm^-1的Mg-O特征峰及≈1396 cm^-1的Mg(OH)2分子振动峰，表明Mg²⁺成功负载于PDA@CeO₂颗粒（图2C）。EDS元素映射进一步证实Ce、O及Mg均匀分布，说明纳米复合结构形成稳定（图2D、E）。此外，GelMA (G)、GelMA(CeO₂) (GC)、GelMA(PDA@CeO₂) (GCP)、GelMA(PDA@CeO₂-Mg) (GCPM)水凝胶均可通过紫外交联成功制备。SEM结果显示，各类水凝胶内部均呈现相互连通、分布均一的多孔结构，孔径范围在100–400 µm之间，且引入C、CP及CPM纳米颗粒后水凝胶结构更加致密，但孔径未发生显著变化（图2F）。该孔径范围被认为适合骨组织工程应用，有利于干细胞黏附、增殖及营养交换。

图2 不同纳米粒子和纳米复合水凝胶的表征。A) C、CP 和 CPM 纳米粒子的代表性 SEM 图像。B) C、CP 和 CPM 纳米粒子的代表性 TEM 图像。C) C、CP 和 CPM 纳米粒子的 FTIR 图像。D、E) C 和 CPM 纳米粒子的代表性 EDS 图像。F) G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶的代表性 SEM 图像

EDS结果显示，GC、GCP和GCPM水凝胶中C、N、O和Ce元素分布均匀，且GCPM中检测到Mg元素（图3A、B），表明各类纳米颗粒成功掺入GelMA水凝胶。FTIR分析显示1650 cm^-1处为C=O伸缩峰，1377 cm^-1为CH₂特征峰，1406 cm^-1为 = C-H峰，550 cm^-1为Ce–O伸缩峰，证实GC、GCP和GCPM均含有CeO₂颗粒（图3C）。水凝胶在24 h动态观察下均表现出良好的溶胀性能（图3D）。力学测试结果表明，水凝胶压缩应力随C、CP及CPM纳米颗粒的加入逐渐增强，其中GCPM最高（图3E、F）。流变学分析显示所有水凝胶的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），表明形成稳定的弹性网络；与纯GelMA相比，GC、GCP和GCPM的G′明显升高，其中GCPM增加最显著（图3G–K）。降解实验显示，所有水凝胶随时间逐渐降解，纯GelMA降解速率最快，而含纳米颗粒的水凝胶降解较慢（图3L）。元素释放实验表明，所有水凝胶均可稳定释放Ce元素，且GCPM能有效释放Mg离子（图3M、N）。

图3 不同纳米复合水凝胶的表征。A、B）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶的代表性 EDS 图像。C）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶的 FTIR。D）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶的动态溶胀行为。E、F）不同水凝胶在压缩状态下的应力-应变曲线以及测量各种水凝胶的压缩模量。G-K）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶从 0.1 到 100 rad s^-1的流变频率扫描。L）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝胶随时间的降解率。M、N）。Ce 和 Mg 释放曲线。 G：GelMA，GC：GelMA(CeO₂ )，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

（2）体外生物相容性评价

良好的细胞相容性是生物材料应用的基本前提。首先进行活/死荧光染色以评估纳米复合水凝胶的毒性。如图4 A所示，仅观察到极少量的死细胞，在第1 天和第 3 天的所有组中大多数细胞仍然存活，表明复合水凝胶是细胞友好的。为了进一步评估细胞增殖，进行了 CCK-8 检测。根据 CCK-8 结果（图 4B，C），在 G，GC，GCP 和 GCPM 水凝胶中，BMSCs 的增殖没有显著差异。此外，还通过细胞骨架染色观察了与不同水凝胶共培养的 BMSCs 的形态。如图 4D所示，BMSCs 充分伸展并伸出触手。这些结果表明复合水凝胶具有优异的生物相容性，支持其在生物医学应用方面的潜力。

图4 体外生物相容性评估。A）第 1 天和第 3 天对 BMSCs 进行活死染色。B、C）第 1 天和第 3 天的 CCK-8 分析。D）第 1 天和第 3 天在不同纳米复合水凝胶上 BMSCs 的 F-actin 和细胞核的代表性荧光图像。结果以平均值±SD 表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。G：GelMA，GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

（3）体外ROS清除能力评价

在H₂O₂诱导的氧化应激环境下，BMSCs在HG组中出现大量死亡细胞，而HGC、HGCP及HGCPM组死亡细胞数量明显减少（图5A、B），提示纳米复合水凝胶对BMSCs具有保护作用。CCK-8检测显示，HG组BMSCs增殖能力显著下降，而HGC、HGCP及HGCPM组的增殖水平均较HG组有所恢复（图5C、D），进一步表明这些水凝胶在氧化应激下改善了细胞活性。DCFH-DA染色结果显示，HG组ROS荧光信号最强，sham组最弱，而HGC、HGCP及HGCPM组均显著降低ROS信号（图5E）。流式细胞术结果一致，HGC、HGCP及HGCPM组细胞ROS荧光强度显著低于HG组（图5F、G），证实其具有有效的ROS清除能力。JC-1染色结果显示，HG组红色荧光明显减弱、绿色荧光增强，提示线粒体膜电位下降；而HGC、HGCP及HGCPM组红色荧光增强、绿色荧光减弱，表明线粒体膜电位得到恢复（图5H），说明水凝胶可通过清除ROS维持线粒体功能。

图5 体外ROS清除能力评估。A、B）用不同水凝胶在H₂O₂ 条件下处理1天和3天的BMSC的活/死染色。C、D）用不同水凝胶在H₂O₂条件下处理1天和3天的BMSC的CCK-8分析。E）BMSC细胞内ROS的代表性图像。F、G）DCFH-DA染色的BMSC细胞内ROS的流式细胞术图像。H）通过JC-1染色中的绿/红百分比确定BMSC的MMP。结果以平均值±SD表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。 S：Sham，HG：H₂O₂ GelMA，HGC：H₂O₂ GelMA(CeO₂)，HGCP：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂)，HGCPM：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂-Mg)。（4）搅打胶原蛋白 (CS10) 和复合生物墨水 (CS73) 的体外细胞活性

（4）体外成骨评价

在氧化应激条件下，BMSCs的成骨分化能力受到显著抑制。ALP染色结果显示，HG组的ALP活性明显减弱，提示早期成骨分化能力下降；相比之下，HGC、HGCP和HGCPM组均呈现更深的染色强度，其中HGCPM组最为明显，表明纳米复合水凝胶可有效恢复ALP水平（图6A）。进一步的ARS染色显示，HG组钙化结节显著减少，而在HGC、HGCP和HGCPM组中钙化沉积逐渐增加，且HGCPM组呈现最强的红色结节，提示晚期成骨分化亦得到显著改善（图6B）。半定量分析结果与染色趋势一致，ALP活性和ARS定量值在纳米复合水凝胶处理组均显著高于HG组，且以HGCPM组提升幅度最大（图6C、D）。

分子水平的检测进一步证实了上述结果。qPCR分析发现，HG组中ALP、Runx2、Col1a1和Ocn等成骨相关基因的表达均明显下调，而在HGC、HGCP和HGCPM组中这些基因均被重新激活，并呈现递增趋势，其中HGCPM组恢复程度最显著（图6E–L）。免疫荧光染色进一步验证了成骨相关蛋白的表达变化：在HG组中，Runx2、Col1和Ocn等蛋白信号均显著减弱，而纳米复合水凝胶干预后荧光信号明显增强，尤其是HGCPM组几乎恢复至正常水平（图6M–R）。

这些结果共同说明，氧化应激会显著抑制BMSCs的成骨分化，而纳米复合水凝胶能够有效缓解这一抑制效应，其中GCPM水凝胶的保护作用最为突出。

图6 体外成骨能力评估。A) 第14天ALP染色的代表性图像。B) 第21天ARS染色的代表性图像。C) 第14天BMSCs的ALP活性。D) ARS染色定量分析钙沉积。E–H) BMSCs在第3天的成骨相关基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）的表达。I–L) BMSCs在第5天的成骨相关基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）的表达。M–R) BMSCs的Col 1、Runx-2和OCN IF染色的IF强度和代表性图像的半定量分析。结果以平均值±SD表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。 S：Sham，HG：H2O2 GelMA，HGC：H₂O₂ GelMA(CeO₂)，HGCP：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂)，HGCPM：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

图7 评估生物结构中的机械转导和肌肉生成。 体外免疫调节能力评估。A–C) RAW264.7 M1 极化和促炎细胞因子 mRNA 表达的相对标志物（iNOS、TNF-α 和 IL-6）。D,E) RAW264.7 M2 极化和抗炎细胞因子 mRNA 表达的相对标志物（CD206 和 IL-10）（n = 5）。F–H) 使用 ELISA 试剂盒检测 RAW264.7 中 TNF-α、IL-6 和 IL-10 的代表性细胞因子分泌情况。I,J) RAW246.7 M1 和 M2 极化标志物的代表性 IF 染色图像

（6）体外血管生成评估

体外血管生成实验显示，GCPM组HUVECs迁移能力最强。划痕实验结果表明，GCPM组伤口闭合率显著高于其他组（图8A、B）；Transwell迁移实验结果也显示GCPM组迁移细胞数量最多（图8C、D）。毛细血管形成实验显示，GCPM组HUVECs形成的管状网络更完整，管状节点数量显著高于其他组（图8E、F），表明GCPM水凝胶具有显著的促血管生成能力。qPCR检测显示，GCPM组在培养1天和3天后HIF-1α、VEGF及VEGFR2基因表达显著高于其他组（图8G–L）。免疫荧光检测进一步显示，GCPM组VEGFR2和HIF-1α蛋白表达明显增强（图8M–P），与qPCR结果一致。上述结果表明，GCPM水凝胶在体外具有良好的促血管生成活性，该作用可能与水凝胶中释放的Mg²⁺有关。

图8 体外血管生成能力评估。A) 血管内皮细胞划痕实验图像。B) 划痕实验定量分析。C) Transwell 小室实验代表性图像。D) Transwell 小室实验定量分析。E) 管腔形成实验代表性图像。F) 管腔形成结构定量分析。G–I) 培养第1天HUVECs血管生成相关基因（VEGF R2、VEGF和HIF-1α）的表达情况。J–L) 培养第3天HUVECs血管生成相关基因（VEGF R2、VEGF和HIF-1α）的表达情况。M–P) HUVECs VEGF R2和HIF-1α IF染色的荧光强度半定量分析及代表性图像

（7）体内新骨形成评估

建立了C57BL/6小鼠双侧卵巢切除（OVX）骨质疏松模型（图9A）。术后8周，体重监测显示OVX导致体重下降（图9B），子宫重量显著低于假手术组（图9C）。Micro-CT分析显示，OVX组股骨骨密度降低，骨小梁稀疏且间断（图9D）；HE染色和TRAP染色进一步确认骨质疏松模型建立成功（图9E、F）。在骨缺损模型中，GC、GCP和GCPM水凝胶均可促进缺损处新骨形成。Micro-CT 3D重建及矢状面、冠状面观察显示，假手术组新骨形成较多，而OVX组骨修复受损；GC、GCP和GCPM组新骨明显增加，其中GCPM组缺损区几乎被新骨完全填充（图9G）。骨体积分析（BV和BV/TV）显示，GC、GCP和GCPM水凝胶均显著促进骨再生，GCPM效果最优。Micro-CT结果表明，纳米复合水凝胶在骨质疏松状态下可显著改善骨修复性能。

图9 体内新骨形成评估。A) 骨质疏松症建模示意图及纳米复合水凝胶体内成骨作用。B) 双侧卵巢切除术后小鼠体重变化。C) 双侧卵巢切除术后子宫重量。D) 股骨远端骨质疏松症的代表性显微CT图像。E) 股骨远端H&E染色的代表性图像。F) 股骨远端TRAP染色的代表性图像。G) 骨缺损周围再生骨的代表性显微CT图像3D重建和切片。H,I) 再生骨组织的BV和BV/TV定量分析

术后8周，组织学染色显示，OVX组颅骨缺损边缘新骨组织较少，骨修复能力低；GC、GCP和GCPM组缺损区新骨明显增加，其中GCPM组骨矿化几乎完全填充缺损区（图10A）。Masson三色染色显示，OVX组缺损区胶原纤维和纤维组织较少，而GC、GCP和GCPM组缺损区覆盖大量胶原纤维和新骨组织（图10B）。免疫组织化学染色结果显示，OVX组Col 1和OCN表达最低，GC、GCP和GCPM组表达显著增加，其中GCPM组Col 1和OCN表达略低于GC和GCP组，可能因骨生成加快使相关因子趋于正常水平（图10C、D）。结果表明，GC、GCP和GCPM水凝胶均能促进骨质疏松缺损的新骨形成，其中GCPM效果最佳。

图10 体内新骨形成评估。A) 骨缺损区域H&E染色代表性图像。B) 骨缺损区域Masson三色染色代表性图像。C) Col 1免疫组织化学染色代表性图像。D) OCN免疫组织化学染色代表性图像。GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@ CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@ CeO₂-Mg)

此外，CD31 染色结果表明，与其他组相比，GCPM 组的 CD31 高阳性数量明显增多（图11A）。以上结果表明，GCPM 水凝胶可通过促进成骨和血管生成来显著增强骨质疏松性骨缺损中的骨再生。最后，进行毒性评价，以评估纳米复合水凝胶在体内的安全性。术后8周内，所有小鼠状态良好。H&E染色结果显示，各组小鼠均未出现明显损伤（图 11B）。这些结果表明，GC、GCP和GCPM水凝胶均具有良好的体内生物相容性。

图11 体内新骨形成评估。A）CD31免疫组织化学染色的代表性图像。B）心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要器官的H&E染色代表性图像。GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)