针对上述问题，四川大学林云锋教授团队设计并构建一种多功能核酸水凝胶（TR21@TS），通过负载miR-21-5p的tFNAs（TR21）与由单宁酸（TA）和四臂聚乙二醇（4-PEG）衍生物组成的止血水凝胶系统（TS）相结合，用于协同调控止血、免疫反应和血管生成，从而促进DWs愈合。该文章于2025年8月7日以《A Sprayable Nucleic Acid Hydrogel for Diabetic Wound Healing via Immunomodulation and Angiogenesis》为题发表于《Small》（DOI: 10.1002/smll.202506587）。

图1. TR21@TS的合成及其在糖尿病伤口愈合中的免疫调节、促血管生成和抗瘢痕效应示意图

（1）TR21和tFNAs的制备与表征

通过Watson-Crick碱基配对，四条单链DNA自组装成tFNAs，并将miR-21-5p加载到tFNAs的粘性末端上，得到复合物TR21（图2a）。PAGE和毛细管电泳（CE）证实了TR21的成功合成（图2b,c）。透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）显示TR21和tFNAs均呈现均匀的三角形结构（图2d,e）。动态光散射（DLS）测量显示TR21的尺寸（14.44 ± 3.68 nm）大于tFNAs（10.72 ± 1.58 nm），且zeta电位更负，进一步证实了miR-21-5p的成功加载（图2f）。稳定性实验表明，TR21在胎牛血清（FBS）和RNase A中比游离miR-21-5p更稳定，并具有良好的储存稳定性（图2g,h）。细胞摄取实验显示，与Cy5标记的游离miR-21-5p (Cy5-R21) 相比，Cy5标记的TR21 (Cy5-TR21) 和tFNAs (Cy5-tFNAs) 在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和RAW264.7巨噬细胞中的摄取效率显著更高（图2i,j）。

图2. TR21的表征。（a）TR21与TR21@TA组成示意图；（b）PAGE凝胶证实TR21合成成功；（c）CE图谱进一步验证TR21合成；（d）tFNAs与TR21的TEM图像（标尺100与25 nm）；（e）tFNAs与TR21的AFM图像（标尺200 nm）；（f）DLS测定tFNAs与TR21的粒径及ζ电位；（g）未降解miR-21-5p相对浓度统计；（h）AGE凝胶展示Cy5-R21与Cy5-TR21在不同FBS浓度（0–10%，37 °C，24 h）及温度（室温、4 °C，0–7 d）下的稳定性；（i）共聚焦荧光图像显示RAW264.7与HUVEC对Cy5-R21、Cy5-tFNAs、Cy5-TR21的摄取（绿：骨架，红：Cy5，蓝：核，3D热图：Cy5荧光强度三维重建；标尺5 μm）；（j）流式细胞术检测RAW264.7与HUVEC对Cy5-R21、Cy5-tFNAs、Cy5-TR21的摄取

（2）TR21@TS的合成与表征

TR21@TS水凝胶通过两步策略合成：将TR21与4-PEG-SS和4-PEG-NH₂整合，然后加入TA形成最终的复合水凝胶（图3a）。¹H NMR证实了4-PEG-NH₂和4-PEG-SS的成功合成（图3b）。该水凝胶表现出快速的凝胶化（≈37秒）、优异的可注射性和可喷涂性（图3c,d）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了水凝胶的合成（图3e）。扫描电镜（SEM）显示TS水凝胶具有微孔结构，且孔隙率高于SS水凝胶（图3f）。TS水凝胶能有效粘附多种大鼠组织和器官（图3g），并表现出比SS水凝胶更优的机械强度和粘附性能（图3h,i,j），这归因于TA通过氢键作用增强了交联和组织粘附。流变学分析确认了TR21@TS水凝胶的凝胶化和稳定性（图3k）。TR21@TS水凝胶在12-24小时期间表现出显著的TR21释放行为。细胞毒性试验（CCK-8）表明，水凝胶提取物（10 mg mL⁻¹）在HUVECs和RAW264.7细胞中均无细胞毒性，且TR21@TS在250 nM浓度下能显著增强细胞活力（图3l）。

图3. TS与TR21@TS水凝胶的制备、表征及细胞毒性评价。（a）TR21@TS凝胶组成示意图；（b）4-PEG-SS与4-PEG-NH₂的¹H NMR谱；（c）TR21@TS与TS的成胶示意图；（d）TR21@TS可注射及可喷涂性能；（e）PEG-SS、4-PEG-NH₂与SS凝胶的FTIR谱；（f）TS与SS凝胶截面SEM（标尺200 μm）；（g）TR21@TS在多器官表面的黏附；（h）TS与SS压缩测试及（i）压缩应力；（j）TS与SS黏附皮肤的剪切-位移曲线；（k）TR21@TS与TS的时间/应变流变；（l）CCK-8统计：RAW264.7与HUVEC经TS、tFNAs@TS、R21@TS、TR21@TS浸提液处理24 h后活性（tFNAs、R21、TR21 250 nM，浸提液10 mg mL⁻¹）

（3）TR21@TS的体外促血管生成活性

划痕实验表明，与对照组和纯水凝胶组相比，所有载药水凝胶均显著增强了HUVECs的迁移能力，其中TR21@TS组的促迁移效果最显著，24小时迁移率约为60%（图4a,b; 图S9）。Transwell实验进一步验证了TR21@TS组迁移的细胞数量约为tFNAs组的两倍（图4c,d）。体外成管实验显示，TR21@TS处理能最有效地促进HUVECs形成毛细血管样网络结构，并显著增加总管长、网格数、网格面积、分支数和连接点数（图4e,f）。蛋白质印迹（WB）和免疫荧光分析表明，TR21@TS处理显著上调了血管内皮生长因子A（VEGF-A）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及磷酸化AKT（p-AKT）的表达（图4g-i,j）。这些结果表明TR21@TS通过激活PI3K/AKT通路并上调VEGF-A和α-SMA来促进血管生成（图4k）。

图4. TR21@TS水凝胶经AKT信号通路促进细胞迁移并增强成管能力。（a）不同水凝胶组在0小时和24小时的划痕实验代表性图像。（b）划痕实验中细胞迁移速率的定量分析（n = 3）。（c）24小时后transwell迁移实验的代表性图像。（d）Transwell实验中细胞迁移数量的定量分析（数据以均值±标准差表示；n = 3)。（e）不同水凝胶组的血管生成实验代表性图像。（f）连接数、分支数量、网格数量及网格面积定量分析。（g,h）HUVECs经不同处理24小时后a-SMA和VEGF-A的免疫荧光图像（细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色；a-SMA和VEGF-A：红色；三维热成像：基于a-SMA和VEGF-A荧光强度的三维重建）。比例尺为5 μm。（i）a-SMA、VEGF-A、AKT及p-AKT表达水平的蛋白质印迹分析。（j）HUVECs经不同处理24小时后a-SMA、VEGF-A、AKT及p-AKT的相对蛋白表达强度（数据以均值±标准差表示；n = 3)。（k）TR21@TS诱导HUVECs血管生成的作用机制示意图

（4）TR21@TS通过巨噬细胞重编程发挥免疫调节作用

为了评估不同处理对巨噬细胞极化的调节作用，用脂多糖（LPS）和高糖条件诱导M1极化。免疫荧光显示，TR21@TS处理组的M1标志物iNOS表达最低，而M2标志物Arginase-1表达最高（图5a,b）。TR21@TS组在降低炎症细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）和活性氧（ROS）水平方面效果最为显著（图5c-g; ）。机制研究表明，TR21@TS处理有效抑制了NF-κB信号通路（降低p-p65/p65比率），并增强了Nrf2/HO-1通路（特别是HO-1）的表达（图5h,i,j）。这表明TR21@TS通过抑制NF-κB和上调Nrf2/HO-1通路来促进巨噬细胞向M2表型极化，从而发挥抗氧化和抗炎作用。

图5. TR21@TS通过抑制NF-κB表达减轻RAW264.7的炎症反应及M1极化。（a）不同处理后RAW264.细胞中iNOS和Arginase-1的免疫荧光图像（细胞骨架绿色，细胞核蓝色，iNOS与Arginase-1红色，3D热成像基于其荧光强度）；（b）iNOS与Arginase-1的定量分析；（c）TNF-α、IL-6和IL-1β的定量分析；（d）ROS的定量分析；（e,f）TNF-α与IL-1β的免疫荧光图像；（g）ROS的免疫荧光图像；（h）LPS诱导炎症及TR21@TS免疫调节机制示意图；（i）NF-κB p65、p-p65、iNOS、Nrf2、HO-1、TNF-α、IL-6、IL-1β相对蛋白表达强度；（j）上述蛋白的Western blot分析（1: Control, 2: LPS, 3: TS, 4: R21@TS, 5: tFNAs@TS, 6: TR21@TS；β-actin为内参）

（5）水凝胶的体内安全性、生物降解性、凝血效率及止血效果

体外凝血实验表明，TS和TR21@TS水凝胶能显著加速血液凝固，凝血时间缩短至约6-8分钟，优于明胶海绵（GS）组（≈11分钟）和对照组（≈18分钟）（图6a,b,c）。凝血指数（BCI）分析显示TR21@TS组的BCI值最低（图6d）。在大鼠肝脏出血模型中，TS和TR21@TS水凝胶几乎能立即止住可见血流，止血时间显著短于对照组和GS组，失血量也最低（图6e,f,g）。溶血实验证实TS水凝胶具有优异的血液相容性（溶血率<5%）（图6h,i）。体内降解实验显示，皮下注射的TR21@TS水凝胶在24-48小时内大量降解，72小时几乎完全降解，仅伴有轻微的早期炎症反应（图6j,k）。主要器官的H&E染色未见明显异常，证实了其良好的生物安全性。体内荧光成像显示，Cy5标记的TR21@TS比游离Cy5-TR21在皮下保留时间更长（可达48小时），表明水凝胶能延长药物滞留（图6l,m）。

图6. GS、TS和TR21@TS水凝胶的体内安全性、生物降解、凝血效率及止血效果。（a）水凝胶体外与体内凝血实验示意图；（b）不同水凝胶包被与未包被孔的时间依赖性凝血；（c）凝血时间统计；（d）血凝指数（BCI）统计；（e）不同水凝胶处理下肝出血面积随时间变化；（f,g）出血时间与失血量比较；（h）溶血照片及（i）溶血率定量；（j）植入后水凝胶宏观形态；（k）植入区H&E与Masson染色（箭头示炎症细胞）；（l）体内成像示意图；（m）Cy5标记TR21与TR21@TS水凝胶体内降解荧光影像

（6）TR21@TS对大鼠糖尿病伤口的体内治疗效果

在STZ诱导的I型糖尿病大鼠模型上创建全层皮肤伤口。TR21@TS处理显著加速了伤口闭合，在第14天时伤口闭合率达到约92%，显著高于对照组（≈65%）及其他治疗组（图7a-d）。H&E染色显示，TR21@TS组在第7天炎症减轻，肉芽组织排列有序，表皮完全再生；到第14天，表皮厚度最薄，表明组织重塑更完全（图7e,f）。Masson染色显示，TR21@TS组在第7天和第14天的胶原沉积最为显著（图7g,h）。

图7. TR21@TS促进糖尿病大鼠皮肤缺损愈合。（a）糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型建立及治疗过程示意图；（b）不同愈合时期伤口代表性图像及创面痕迹；（c）各组愈合过程中伤口闭合率统计；（d）第14天伤口闭合率定量；（e）第7和14天伤口切片H&E染色；（f）第7和14天相对伤口长度统计；（g）第7和14天Masson染色；（h）基于Masson染色的胶原沉积定量

（7）TR21@TS水凝胶通过免疫调节和促进血管生成加速伤口愈合

基于体外结果，推测TR21@TS通过抑制NF-κB促进巨噬细胞M2极化，并通过上调PI3K/AKT通路促进血管生成，从而加速糖尿病伤口愈合（图8a）。对第7天TR21@TS组和对照组伤口组织进行RNA测序（RNA-Seq）分析。主成分分析（PCA）和差异表达基因分析显示两组间转录谱存在显著差异（图8b; 图S14）。通路富集分析表明，TR21@TS显著调节了炎症、角质形成细胞增殖和细胞外基质合成，并显著富集于NF-κB和PI3K/AKT信号通路（图8c）。基因集富集分析（GSEA）证实TR21@TS上调了PI3K通路（图8d,e），并下调了NF-κB信号通路和炎症反应通路（图8g）。多个血管生成相关基因在TR21@TS组上调（图8f）。免疫组化（IHC）分析显示TR21@TS组血管标志物CD31的表达显著上调，表明新生血管形成增加（图8h,i）。免疫荧光分析显示，TR21@TS组在第14天下调了与瘢痕形成相关的转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达（图8j,k）。对第7天组织进行免疫荧光染色显示，TR21@TS处理显著降低了M1巨噬细胞（CD86+F4/80+）的比例，同时增加了M2巨噬细胞（CD206+F4/80+）的比例，并显著降低了炎症细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）的水平（图9a-i）。

图8. 不同处理下创面的转录组测序分析、血管生成及疤痕减少评估。（a）TR21@TS水凝胶免疫调节、促血管生成及抗疤痕机制示意图；（b）差异基因火山图；（c）GO上下调通路富集（红色箭头示TR21@TS最相关通路）；（d）PI3K通路的GSEA；（e）PI3K相关热图；（f）血管生成相关热图；（g）NIK/NF-κB与炎症反应通路的GSEA；（h）CD31阳性区域统计；（i）CD31免疫组化图像；（j）TGF-β1荧光定量；（k）TGF-β1免疫荧光图像（绿色示TGF-β1，蓝色为细胞核，3D热图基于荧光强度重建）

（8）TR21@TS水凝胶通过免疫调节加速伤口愈合

探讨了TR21@TS对巨噬细胞极化的调节作用。通过免疫荧光染色检测第7天组织样本中CD86与CD206的表达，并使用F4/80标记巨噬细胞。对照组中M1型巨噬细胞标志物CD86呈现高表达，而M2型标志物CD206表达最低；相反，TR21@TS处理组则表现出CD86表达下降和CD206表达上升的趋势（图9a，b）。定量分析显示，与对照组（约37.8%）相比，tFNAs@TS组（约11.3%）与TR21@TS组（约8.1%）中CD86⁺巨噬细胞比例显著降低，同时CD206⁺巨噬细胞比例明显增加（图9c-e）。值得注意的是，TS、R21@TS及DM组之间未见显著差异，表明tFNA在促进细胞摄取miR-21-5p中具有重要作用。此外，对IL-1β、IL-6和TNF-α的免疫荧光染色及半定量分析表明，TR21@TS处理显著减轻炎症反应，尤其在IL-1β和IL-6水平上，与tFNAs@TS组相比差异具有统计学意义（图9f-i）。

图9. TR21@TS基于巨噬细胞对创面的抗炎与免疫调节作用。（a,b）不同处理后皮肤组织中F4/80、CD80及CD86的免疫荧光图像与定量；（c）F4/80标记巨噬细胞定量；（d）F4/80与CD86标记M1型巨噬细胞定量；（e）F4/80与CD206标记M2型巨噬细胞定量；（f）TNF-α定量；（g,h）TNF-α、IL-1β与IL-6免疫荧光图像（绿色示细胞因子，蓝色为细胞核，3D热图基于荧光强度重建）；（i）IL-1β与IL-6定量