针对上述问题，四川大学华西医院张晖教授设计了一种源自中草药的自适应刺激响应型水凝胶，采用两亲性胶束PEG-S-S-PLGA来负载Pae，解决其水溶性差的问题，再将负载Pae的胶束(MIC@Pae)添加到OBPG水凝胶中，构建了OBPG&MP水凝胶药物递送系统。注射到伤口后，能够快速消除细菌并减轻氧化应激，促进皮肤修复环境的形成。随后，慢性伤口中的活性氧(ROS)打破MIC@Pae中的二硫键，持续释放白芍根提取物——芍药苷(Pae)，促进巨噬细胞向M2表型极化和新生血管形成，加速皮肤细胞外基质的重塑和胶原沉积，最终加速慢性伤口愈合。该文章于2024年04月30日以《A Multifunctional Herb-Derived Glycopeptide Hydrogel for Chronic Wound Healing》为题发表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202400516）。

方案1. 多功能草药衍生的糖肽 OBPG&MP 水凝胶在慢性伤口愈合中的设计和应用示意图

（1）材料合成与表征

通过¹H NMR对PEG-S-S-PLGA的结构进行了表征，特征峰分别出现在3.6 ppm和1.2 ppm，归属于PEG基团中的亚甲基和PLGA中的甲基，其他特征峰出现在3.1 ppm和2.7 ppm，说明PEG-S-S-PLGA结构的成功合成。PEG-S-S-PLGA用于包裹疏水性药物Pae，UV光谱显示MIC@Pae中Pae的特征吸收峰（242 nm），表明药物成功包裹，包封率为46.5%，粒径和Zeta电位分析显示载药后电位升高，但粒径无显著变化。通过H₂O₂验证了其对氧化还原反应的响应性，显示在ROS条件下，MIC@Pae的粒径减小，Zeta电位升高，形貌发生变化，PDI值增加，说明成功制备了ROS响应型胶束。PLY-GA通过酰胺缩合反应合成，¹H NMR和FTIR证实了GA成功接枝，UV光谱显示GA的特征峰，GA的取代度约为16.9%，OBSP通过BSP在NaIO4氧化下合成，¹HNMR和FTIR表明其结构变化，成功制备了OBSP。

图1. MIC@Pae、PLY-GA 和 OBSP 的表征。a）MIC、Pae MIC@Pae 的紫外-可见光谱；b，c）生理和高ROS的条件下 MIC@Pae 的代表性 TEM 图像（比例尺：50 nm）；d，e）MIC、MIC@Pae、MIC@Pae的Zeta电位和平均粒径；f，g）与 ROS 孵育后MIC@Pae的大小分布和 PDI 值的变化；h–j）PLY-GA 的合成路线、1H NMR波谱和FTIR波谱；k，l）OBSP 的1H NMR波谱和FTIR波谱

（2）水凝胶的制备与表征

本研究使用的糖肽OBPG水凝胶通过将等体积的OBSP溶液和PLY-GA溶液在室温下混合制备，扫描电镜（SEM）和元素映射显示其均匀的多孔结构，有利于药物负载和细胞募集。随后，在凝胶化前向水凝胶中加入浓缩的MIC@Pae溶液，形成了OBPG&MP药物释放系统。SEM图像显示MIC@Pae均匀分布在水凝胶骨架上，且元素映射与EDS分析证实了其均匀结构。由于Schiff碱键的动态可逆性和pH敏感性，OBPG&MP水凝胶展现了优异的注射性、自愈合能力和响应性。这些特性使其能够适应不规则伤口，并通过自愈合功能修复因运动引起的损伤，流变学测试进一步证实了水凝胶的自修复能力及其内部弹性网络的形成。水凝胶还具有较好的粘附性，能够稳定附着在伤口上，为皮肤再生提供理想的微环境。在模拟生理条件下，水凝胶表现出良好的吸液能力，在12小时内达到吸收平衡，48小时后溶胀比降低，表明水凝胶开始降解，降解行为的进一步评估显示，水凝胶在7天内逐步降解，便于敷料的去除而不损伤新生组织。此外，OBPG&MP水凝胶具有pH和活性氧（ROS）响应性，可通过酸性或ROS触发智能药物释放机制，在酸性或ROS条件下Pae的释放速率显著提高，持续至少72小时。

图2. 水凝胶的表征。a）OBPG 水凝胶的凝胶化；b，c）OBPG 和 OBPG&MP 水凝胶的 SEM 图像（比例尺：100 μm）；d）OBPG&MP 水凝胶的 EDS 元素映射；e）OBPG&MP 水凝胶的注射性、自愈性和响应能力的示意图；f）OBPG&MP水凝胶注射的可视化；g）OBPG&MP 水凝胶自愈能力的可视化；h，i）水凝胶的流变特性；k）OBPG&MP 水凝胶的 pH响应途径和宏观观察；l）不同环境下OBPG &MP水凝胶的 Pae 释放动力学；m，n）OBPG&MP 水凝胶的溶胀和降解性能

（3）水凝胶的生物相容性和抗氧化性

通过细胞毒性和溶血实验评估了OBPG&MP水凝胶的生物相容性，在细胞毒性实验中，使用小鼠成纤维细胞（L929）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与水凝胶浸提液共培养3天，结果显示大多数细胞保持正常的增殖状态，且细胞存活率超过95%。溶血实验表明，OBPG&MP水凝胶的溶血率小于5%，符合生物材料的血液相容性标准。此外，细胞迁移实验显示，水凝胶在促进细胞迁移方面具有显著效果，尤其在伤口愈合过程中表现出很大的潜力。抗氧化测试结果表明，该水凝胶能有效清除羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢，且在模拟的氧化应激环境中，对细胞的抗氧化保护作用显著。这些特性使OBPG&MP水凝胶能够加速伤口愈合，防止氧化损伤。

图3. 水凝胶的生物相容性和抗氧化能力。a-c）L929 和 HUVEC 与水凝胶浸提液一起孵育的活/死染色和 CCK-8 测定（比例尺：50 μm）；d）水凝胶的血液相容性；e）LPS 激活的 L929 划痕愈合率与水凝胶浸提液一起孵育；f）OBPG 和 MP 水凝胶的 ROS 清除能力示意图；g-i）水凝胶对·OH─、O2−和 H2O2的清除率；j，k）DCFH-DA 指示剂检测的水凝胶的细胞内 ROS 清除能力（比例尺：50 μm）

（4）水凝胶的抗菌活性

PLY在感染伤口中展现了广谱抗菌活性，并且价格低廉，适合作为抗菌水凝胶的材料。本研究通过在PLY的侧链上接枝GA，增强了水凝胶的生物功能。抗菌实验结果表明，PLY-GA对常见慢性伤口病原菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的抗菌率分别为96.2%和94.0%。其抗菌机制依赖于静电作用，正电荷的PLY-GA分子穿透负电荷的细菌细胞壁，导致细胞膜失去选择性，细菌自溶死亡。此外，OBPG&MP水凝胶的抗菌性能也得到了多种表征验证。光密度法显示，该水凝胶对S. aureus和P. aeruginosa的抗菌率分别为97.2%和97.8%，平板培养法和活/死细菌染色法也证实了其显著的抗菌效果。扫描电镜和透射电镜结果表明，与细菌共孵育后，细菌的膜结构受损，表现出凹陷和破裂，内容物泄漏。这是由于细菌膜带负电，而水凝胶中的-NH2在水中质子化后带正电，与细菌膜发生电荷相互作用，破坏其结构。总之，OBPG&MP水凝胶表现出优异的抗菌活性，有助于促进感染部位的伤口愈合。

图4. 水凝胶的抗菌能力。a）OBPG&MP水凝胶抗菌机制示意图；b，c）水凝胶的抑菌率；d）不同组 LB 平板上的细菌菌落；e）与水凝胶共培养的细菌的活/死染色（比例尺：20 μm）；f，g）不同组细菌的代表性 SEM 和 TEM 图像（比例尺：200 nm，1 μm）

（5）水凝胶的免疫调节能力

巨噬细胞是局部和全身炎症的主要调节者，并在伤口愈合中发挥不可或缺的作用。巨噬细胞的极化指的是在特定时间和位置激活巨噬细胞，它们具有足够的可塑性以响应不同的生物信号，极化为不同的表型。伤口修复中的巨噬细胞主要表现为两种表型：促炎的M1型和抗炎的M2型，M1向M2的转变对于伤口愈合至关重要，但在慢性伤口中经常停滞，生物材料的生化特性可能会影响巨噬细胞的极化。本实验使用RAW 264.7细胞评估了OBPG&MP水凝胶对巨噬细胞极化的影响。结果显示，OBPG水凝胶能够减少M1型标志物iNOS的表达，增加M2型标志物CD206的表达，具有抗炎作用并促进M2型巨噬细胞的极化。此外，水凝胶还减少了促炎因子IL-6的表达，增加了抗炎因子IL-10的水平。通过抑制STAT3通路并激活STAT6通路，OBPG&MP水凝胶促进了M1型向M2型巨噬细胞的转化，有助于减轻慢性伤口的炎症并促进愈合过程。这可能与水凝胶中添加的中药成分BSP和Pae有关，但具体机制尚不明确。

图5. 水凝胶的免疫调节。a）不同组巨噬细胞极化的代表性免疫荧光染色图像（M1：iNOS，M2：CD206，比例尺：100 μm）；b，c）用不同水凝胶处理后 iNOS 和 CD206 的相对mRNA表达；d）不同组中促炎细胞因子 IL-6 和抗炎细胞因子 IL-10 的代表性免疫荧光染色图像（比例尺：100 μm）；e，f）用不同水凝胶处理后 IL-6 和 IL-10 的相对mRNA表达；g）OBPG&MP 水凝胶的免疫调节和抗炎机制示意图；h） WB检测的不同组中STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6、iNOS、IL-6、CD206和IL-10的表达

（6）水凝胶的促血管化能力

慢性伤口无法愈合的主要原因之一是通过血管生成再生微血管系统的能力降低，促进新生血管生成可以促进细胞外基质（ECM）的重塑并增强皮肤再生。中药及其活性成分因其在治疗缺血性疾病中的悠久历史，已被广泛研究其潜在的促血管生成特性，Pae是芍药中的主要活性成分，已在内皮细胞和血管功能障碍的斑马鱼模型中显示出血管生成特性。研究表明，Pae可以增强血管生长因子的分泌，促进内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成，并在缺血性中风大鼠模型中显著缓解脑梗死，增加脑血管密度。同时，BSP（黄芪多糖）通过上调VEGF表达并促进细胞迁移，加速伤口愈合。因此，推测OBPG水凝胶中的BSP和Pae的持续释放可通过促进内皮细胞分泌生长因子来刺激血管生成。在伤口愈合过程中，血管生成与血管内皮细胞分泌的生长因子（如VEGF和HIF-1α）密切相关。实验结果表明，OBPG&MP组显著提高了VEGF和HIF-1α的水平，并通过管形成实验证实水凝胶促进了血管新生。这些结果表明，OBPG&MP水凝胶显著提高了血管生成因子的表达，促进了新生血管形成，有助于慢性伤口的血管再生和内皮修复。

图6. 水凝胶的促血管化能力。a）OBPG &MP 水凝胶血管生成机制的示意图；b）不同组中生长因子 VEGF 和 HIF-1α 的代表性免疫荧光染色图像（比例尺：100 μm）；c–e）WB 和 PCR 检测不同组 VEGF 和 HIF-1α 的表达；f-h）不同组中的代表性试管形成图像和定量试管长度和强度（比例尺：100 μm）

（7）水凝胶促进感染慢性伤口愈合

体外研究表明，OBPG&MP水凝胶具有优异的生物相容性、抗菌性、清除活性氧（ROS）的能力、免疫调节功能以及促进血管生成的特性。为了评估水凝胶在体内促进慢性伤口愈合的效果，研究采用了金黄色葡萄球菌感染的糖尿病大鼠皮肤缺损模型。通过链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病模型，并在糖尿病模型中制作全层皮肤损伤，感染金黄色葡萄球菌以模拟感染性伤口。实验使用了OBPG&MP水凝胶、OBPG水凝胶、MIC@Pae溶液、Hydrosorb标准敷料等进行对比治疗。结果显示，OBPG&MP水凝胶组的伤口愈合效率显著优于其他组，在第7天，OBPG&MP水凝胶组的伤口收缩率为75.2%，显著高于对照组的36.2%；第14天时，OBPG&MP水凝胶组的伤口几乎完全愈合，收缩率为98.1%，超过了其他对照组。此外，HE染色显示，各组内脏组织形态未见显著差异，证明OBPG&MP水凝胶具有良好的生物相容性。进一步研究表明，OBPG&MP水凝胶具有显著的抗菌和抗氧化能力，有效减少了伤口微环境中的细菌和氧化应激水平。H&E和Masson染色结果显示，OBPG&MP水凝胶在第7天时促进了伤口边缘收缩，并减少了炎症细胞的浸润；第14天时，水凝胶组已实现完全的重新上皮化，并且炎症细胞显著减少，胶原沉积密集且有序，表皮和真皮组织结构恢复良好。这些结果表明，OBPG&MP水凝胶通过加速伤口收缩、重新上皮化和胶原沉积，促进了慢性伤口的修复。

图7. 水凝胶促进慢性伤口愈合的作用。a）处理程序示意图；b）不同治疗后伤口愈合痕迹的代表性图像（比例尺：5 mm）；c）不同治疗的伤口收缩率；d，e）水凝胶的体内抗菌能力；f）各组DHE 的代表性免疫荧光染色图像（比例尺：100 μm）；g-i） 第 14 天不同组再生皮肤中伤口边缘、毛囊和胶原蛋白沉积的定量；j，k）通过 HE 和 Masson 染色对再生皮肤进行组织学评估（伤口边缘：蓝色箭头，血管：黄色箭头，毛囊：绿色箭头，比例尺：2 和 200 μm）

（8）免疫荧光染色

M1向M2巨噬细胞的逐步转变标志着炎症向增殖阶段的过渡，结合OBPG&MP水凝胶在体外实验中诱导M1巨噬细胞向M2极化的结果，研究进一步调查了伤口中巨噬细胞的极化状态和炎症程度。双重免疫荧光染色显示，水凝胶组中M1巨噬细胞数量减少，M2巨噬细胞数量增加，表明炎症减轻、抗炎特性增强。此外，免疫组织化学结果显示，OBPG&MP水凝胶显著降低了促炎细胞因子IL-6的水平，同时增加了抗炎因子IL-10的表达。研究还表明，血管生成对于慢性伤口愈合至关重要。通过双重免疫荧光染色分析，水凝胶组显示出更多成熟的大血管，表明其具有良好的促血管生成能力。ELISA结果进一步确认了这些发现，表明OBPG&MP水凝胶在炎症因子和血管标志物表达上具有显著影响。此外，水凝胶促进了I型和III型胶原蛋白的沉积与重塑，提高了伤口组织的强度和完整性。

图8. OBPG&MP 水凝胶对伤口愈合的免疫荧光染色。a）不同组巨噬细胞极化的免疫荧光染色 （M1：iNOS，M2：CD206，比例尺：100 μm）；b，c）IL-6和IL-10的代表性免疫组织化学染色图像（比例尺：100 μm）；d）不同组中新形成的血管生物标志物 CD31 和 α-SMA 的免疫荧光染色（比例尺：100 μm）；e）不同组胶原蛋白 I/III 的免疫荧光染色（比例尺：100 μm）；f-i） 第 7 天通过 ELISA 评估炎症因子 IL-6 和 IL-10 以及血管生物标志物 VEGF 和 CD31 的表达水平