针对上述问题，山东大学晶体材料国家重点实验室和齐鲁医院神经外科仇吉川教授、刘宏教授、桑元华教授、齐鲁医院李刚教授和基础医学院易凡教授团队联合设计了钛酸钡/还原氧化石墨烯（BTO/rGO）杂化压电纳米贴片，用于创伤性脑损伤（TBI）的神经干细胞（NSC）治疗。该纳米贴片经超声激活，可在NSC膜表面产生长期压电电位，激活电压门控钙通道（VGCC）等下游信号通路，加速NSC的神经元分化和成熟。在大鼠TBI模型中，移植带有BTO/rGO纳米贴片的NSC并结合超声刺激，28天内可显著修复脑组织并恢复生理功能。相关成果于2025年5月6日以《Ultrasound-activated piezoelectric nanostickers for neural stem cell therapy of traumatic brain injury》为题发表于《Nature Materials》（DOI：10.1038/s41563-025-02214-w）。

研究示意图

（1）BTO纳米颗粒无法诱导神经元分化

四方相钛酸钡（BTO）纳米粒子呈立方体形状，平均边长200 nm（图1a,b）。选区电子衍射图像显示其具有四方晶系衍射图案（图1c）。高分辨率透射电子显微镜图像确认晶面间距分别为0.401纳米和0.399纳米，对应四方晶系BTO的（001）和（100）晶面（图1c）。扫描透射电子显微镜（STEM）和能量色散X射线分析（EDX）确认了BTO纳米粒子中Ba、Ti和O的存在及其均匀分布（图1d）。X射线衍射图谱中2θ=45°处的峰分裂对应四方相BTO的（002）和（200）衍射峰，进一步确认其四方晶系结构（图1e）。压电力显微镜显示BTO纳米粒子具有压电响应和极化切换行为（图1f）。超声辐射下，固定BTO纳米粒子的微电极产生约0.8 mV的周期性电压（图1g）。BTO纳米粒子与神经干细胞（NSC）共培养后超声辐射，未发现神经元标志物Tuj1和MAP2的基因或蛋白表达水平有显著差异（图1h-k）。BTO+超声处理在第3天杀死了近10%的NSC，并抑制其增殖（图1m,n）。BTO+超声处理诱导NSC中显著的活性氧（ROS）生成（图1o,p）。BTO纳米粒子被内化到溶酶体中，在酸性环境中，压电电位易引发氧进化反应并生成ROS（图1q）。为防止BTO纳米粒子内吞，设计了BTO/还原氧化石墨烯（rGO）杂化压电纳米贴片，将BTO纳米粒子附着在二维rGO纳米片表面。

图1 BTO 纳米粒子的特性及其对 NSC 的影响。（a）BTO纳米粒子的SEM图像；（b）BTO纳米粒子的代表性TEM图像；（c）BTO纳米粒子的代表性高分辨率TEM和选区电子衍射（插图）图像；（d）BTO纳米粒子的代表性STEM图像；（e）BTO纳米粒子的X射线衍射分析，a.u.为任意单位；（f）BTO纳米粒子的相滞回线和蝴蝶滞回线；（g）BTO纳米粒子在超声照射下的电信号，右图为部分信号放大图像，箭头指示超声施加时刻；（h）和（i）为5天后神经干细胞中Tuj1（h）和MAP2（i）的mRNA水平；（j）和（k）为5天后神经干细胞的Western blot（j）和相关分析（k）；（l）和（m）为3天后活/死检测（l）和神经干细胞存活率分析（m）的图像；（n）为神经干细胞的CCK-8检测结果；（o）为不同处理下神经干细胞中ROS水平的测量；（p）为ROS水平的统计分析；（q）为溶酶体和BTO纳米粒子共定位的代表性图像

（2）BTO/rGO 纳米贴片的合成与生物相容性

BTO纳米粒子通过化学组装固定在氧化石墨烯纳米片上，经水溶液还原处理后合成BTO/rGO杂化压电纳米贴片。扫描电子显微镜和透射电子显微镜图像显示BTO纳米粒子牢固附着在rGO纳米片上，形成灵活片状纳米结构（图2a,b）。电子探针X射线显微分析和STEM图像确认BTO纳米粒子附着后仍保持立方体形状和化学组成（图2c）。相电压滞回线和铁电蝴蝶滞回线证实杂化纳米贴片具良好压电性能（图2d）。多电极阵列评估显示，单个BTO/rGO纳米贴片在超声辐射下可产生1毫伏压电电位（图2e,f），而单独rGO纳米片无电位输出。荧光和SEM图像显示BTO/rGO纳米贴片紧密附着在NSC膜上（图2g,h），有利于压电电荷转移。DCFH-DA染色显示，共培养NSC在超声辐射下未产生ROS（图2i,j）。活/死染色（图2k,l）、EdU增殖实验（图2m,n）和CCK-8实验（图2o）表明，BTO/rGO纳米贴片在超声辐射下对细胞活性或增殖无副作用，限制压电电位在膜外可防止由内吞BTO纳米粒子引起的细胞毒性ROS。BTO/rGO杂化压电纳米贴片具有良好生物相容性，可作为细胞外纳米贴片产生压电电荷刺激细胞膜受体，且不诱导细胞内产生细胞毒性ROS。

图2 BTO/rGO 纳米贴纸的特性和生物相容性。（a）BTO/rGO纳米贴片的SEM图像；（b）BTO/rGO纳米贴片的代表性TEM图像；（c）BTO/rGO纳米贴片的代表性STEM图像；（d）BTO/rGO纳米贴片的相滞回线和蝴蝶滞回线；（e）单个rGO纳米片或BTO/rGO纳米贴片在超声照射下通过MEA产生电信号的测量方法示意图；（f）单个BTO/rGO纳米贴片在超声照射下产生的电信号，右图为部分信号放大图像，箭头指示超声施加时刻；（g）NSCs与BTO/rGO纳米贴片之间位置关系的代表性图像（绿色，BTO/rGO纳米贴片；红色，NSCs的细胞膜；蓝色，Hoechst）；（h）BTO/rGO纳米贴片与NSCs之间位置关系的SEM图像及相应的Ba和Ti的能谱X射线分析映射；（i）不同处理后的NSCs中的ROS水平；（j）ROS水平的统计分析；（k）活死染色实验图像；（l）3天后神经干细胞（NSCs）存活率分析；（m）神经干细胞（NSCs）的Edu增殖实验结果（绿色，增殖细胞；蓝色，Hoechst）；（n）通过Edu增殖实验评估的神经干细胞增殖能力；（o）神经干细胞的CCK-8实验结果

（3）BTO/rGO 纳米贴片促进神经元分化

超声激活的BTO/rGO压电纳米贴片对NSC神经元分化的促进作用在基因和蛋白水平上得到评估。如图3a–f所示，BTO/rGO+超声（US）处理显著增加了Tuj1和MAP2的基因和蛋白表达，但不影响胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达，表明该处理促进了NSC向神经元分化，而不影响神经胶质分化。在相同培养条件下，只有四方相BTO/rGO+超声处理（T-BTO/rGO+US）促进了NSC向神经元分化，而rGO纳米片或非压电立方相BTO/rGO纳米贴片（C-BTO/rGO）无此效果（图3g–k），说明压电信号在NSC神经元分化中起关键作用。第7天的免疫荧光分析显示，BTO/rGO+US组的NSC具有更高的Tuj1表达，分化出更多神经元，其中约15%的细胞为Tuj1阳性神经元，而其他组仅有约7%（图3l,m）。

图3 BTO/rGO压电纳米贴纸促进神经元相关生物标志物的表达。（a）超声激活的 BTO/rGO 压电纳米贴片促进神经干细胞向神经元分化的示意图。（b–d）5 天后神经干细胞中 Tuj1（b）、MAP2（c）和 GFAP（d）的 mRNA 水平。（e，f）5 天后神经干细胞中的 Western blot（e）及关联分析（f）。（g，h）加入对照组后 5 天培养的神经干细胞中 Tuj1（g）和 MAP2（h）的 mRNA 水平。（i–k）加入对照组后 5 天培养的神经干细胞中的 Western blot（i）及 Tuj1（j）和 MAP2（k）的关联分析。（l）第 7 天的 Tuj1/GFAP 免疫荧光染色。（m）基于 Tuj1/GFAP 免疫荧光染色的分化神经元与总神经干细胞的比率

（4）BTO/rGO 纳米贴片加速神经元的成熟

在第10天，BTO/rGO+US组神经元数量显著增多且突触长度更长（图4a）。Sholl分析显示，BTO/rGO+US组分化神经元的神经突复杂度最高（图4b），表明超声激活的BTO/rGO压电纳米贴片可加速分化神经元成熟。实时钙离子成像和荧光强度分析表明，第5天时BTO/rGO+US组分化神经元出现明显钙离子流入流出（图4c,d中黄色箭头所示），而其他三组未观察到该现象，说明无BTO/rGO+US处理时，NSC未分化成功能性神经元。BTO/rGO+US组在第10天和第15天的MAP2水平更高，轴突更长，神经网络更复杂（图4e,f）。西方印迹法证实，第10天BTO/rGO+US组神经元分化程度显著高于第15天TCP组（图4g–i），即BTO/rGO+US处理诱导分化的神经元成熟速度至少加快5天。与突触相关的标记物GAP43、PSD95、SYP在BTO/rGO+US组表达水平高于其他三组（图4j–o），表明压电刺激加速了突触成熟。这些结果表明，仅需5天超声激活BTO/rGO压电纳米贴片处理，就能加速NSC向成熟神经元分化，促进突触和网络快速构建，对修复受损神经系统及实现快速NSC基础的TBI治疗意义重大。

图4 BTO/rGO 压电纳米贴纸加速神经元成熟和突触形成。（a）第10天的MAP2/GFAP免疫荧光代表性图像。DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；（b）第10天NSC来源神经元的Sholl分析；（c，d）实时钙离子成像（c）和代表性细胞在不同时间的荧光强度统计分析（d）；（e）第10天和第15天的MAP2/GFAP免疫荧光代表性图像；（f）第10天和第15天NSCs的Sholl分析；（g–i）第10天和第15天NSCs中Tuj1和MAP2的Western blot（g）以及相关的Tuj1（h）和MAP2（i）分析；（j）Tuj1/GAP43的免疫荧光染色；（k）GAP43荧光强度的统计分析；（l）Tuj1/PSD95的免疫荧光染色；（m）PSD95荧光强度的统计分析；（n）Tuj1/SYP的免疫荧光染色；（o）SYP荧光强度的统计分析

（5）验证细胞内下游机制

信使RNA测序结果显示，钙离子相关信号通路对超声激活的BTO/rGO压电纳米贴片诱导的NSC神经元分化至关重要。图5a显示，BTO/rGO+US处理后细胞内钙离子浓度显著增加，表明BTO/rGO+US诱导的压电位促进了钙离子内流。图5b显示，BTO/rGO+US处理3天后，Tuj1和MAP2蛋白水平显著高于其他组。使用钙离子螯合剂BAPTA-AM抑制下游信号传导后，图5d显示BAPTA-AM显著抑制了BTO/rGO+US组NSC的加速分化，表明钙离子在促进NSC神经元分化的信号通路中起关键作用。研究表明，超声激活的BTO/rGO纳米贴片产生的压电信号通过钙相关的膜受体启动了钙离子内流和随后的信号传导。使用特异性抑制剂阻断VGCC、Piezo1和TRPC1三种通道后，图5f–h显示用ω-蝎毒素-Hv1a（Hv1a）阻断VGCC显著抑制了钙离子内流及BTO/rGO+US组NSC的神经元分化，而图5i–k显示抑制Piezo1和TRPC1未产生影响，表明VGCC是压电信号向细胞内钙信号转导的关键通道。蛋白质印迹实验显示，与TCP组相比，BTO/rGO+US组3天后磷酸化CaMK II（P-CaMK II）表达上调4.9倍，磷酸化CREB（P-CREB）表达增加3.3倍，BDNF表达增加5.4倍（图5l,m）。免疫荧光染色显示，BTO/rGO+US组中NSCs的P-CaMK II、P-CREB和BDNF表达水平升高（图5n–p）。酶联免疫吸附测定检测到BTO/rGO+US组培养基中BDNF浓度增加（图5q）。上述结果表明，压电纳米贴片诱导的神经元分化过程中，关键信号由压电势产生，通过VGCC/Ca²⁺/CaMK II/CREB通路转导，最终提高BDNF表达（图5r）。

图5 BTO/rGO 压电纳米贴纸激活 VGCC 并诱导细胞内信号转导。（a）对不同处理条件的 NSCs 进行钙离子成像（i）及其相关的统计分析（ii）；（b）3 天后 NSCs 的 Western blot（i）及其相关的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（c）BAPTA-AM 作用于钙离子的作用机制示意图；（d）使用或未使用 BAPTA-AM 处理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相关的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（e）钙离子进入细胞的途径示意图；（f）Hv1a 作用于 VGCC 的作用机制示意图；（g）使用或未使用 Hv1a 处理的 NSCs 的钙离子成像（i）及其相关的统计分析（ii）；（h）使用或未使用 Hv1a 处理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相关的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（i）GsMTX4 作用于 Piezo1 和 TRPC1 的作用机制示意图；（j）使用或未使用 GsMTX4 处理的 NSCs 的钙离子成像（i）及其相关的统计分析（ii）；（k）使用或未使用 GsMTX4 处理的 NSCs 的 Western blot（i）及其相关的 Tuj1（ii）和 MAP2（iii）分析；（l，m）3 天不同处理条件的 NSCs 的 Western blot（l）及其相关的分析（m）；（n）第 3 天的 P-CaMK II 免疫荧光染色（i）及其相关荧光强度统计分析（ii）；（o）第 3 天的 P-CREB 免疫荧光染色（i）及其相关荧光强度统计分析（ii）；（p）第 3 天的 BDNF 免疫荧光染色（i）及其相关荧光强度统计分析（ii）；（q）通过酶联免疫吸附测定测量 NSC 分泌的 BDNF 量；（r）超声激活的 BTO/rGO 纳米贴片产生的压电信号作用于 VGCC 和细胞内信号转导的机制示意图

（6）基于NSCs的治疗加速了大鼠TBI后的恢复

本研究构建大鼠TBI模型，评估超声激活的BTO/rGO压电纳米贴片在基于NSC的神经再生治疗中的效果。实验分9组，术后1、7、14、21、28天进行神经功能缺损评分。结果显示，TBI+NSC+BTO/rGO+US组得分最低，第28天能在平衡梁上停留超60秒（图6b），在高架身体摆动测试中表现最佳（图6c），表明该组大鼠神经功能恢复显著改善。术后28天分析大鼠脑组织样本，TBI+NSC+BTO/rGO+US组脑组织空洞被新生神经组织填充（图6d）。HE染色显示该组未修复损伤区域面积最小且修复组织排列有序（图6e）。尼氏染色显示，该组大鼠脑组织尼氏体正常，其他组则变薄、变小甚至溶解（图6f）。免疫荧光染色显示，该组大多数移植的NSC（经PKH26标记）分化成功能性神经元（图6g,h），且该组中移植的NSC产生的成熟和未成熟神经元数量更多（图6i–l），表明超声激活的BTO/rGO纳米贴片促进了NSC向神经元分化，增强了神经功能恢复和脑组织再生。总之，超声激活的BTO/rGO压电纳米贴片提高了基于NSC的疗法的有效性，为TBI治疗提供了巨大潜力。

图6 基于NSC的治疗加速神经功能恢复和组织再生。（a）TBI实验示意图；（b）九组在治疗期间神经功能严重程度评分；（c）九组在治疗期间体摆动测试结果；（d）治疗28天后脑部代表性图像；（e）脑部HE染色代表性全景扫描和局部放大图像，每组每张图像来自一只大鼠；（f）脑部尼氏染色代表性图像，每组每张图像来自一只大鼠；（g）实验动物治疗28天后脑组织切片NeuN免疫荧光染色；（h）NeuN阳性细胞与移植NSCs的比例；（i）实验动物治疗28天后脑组织切片MAP2免疫荧光染色；（j）MAP2阳性细胞与移植NSCs的比例；（k）实验动物治疗28天后脑组织切片Tuj1免疫荧光染色；（l）Tuj1阳性细胞与移植NSCs的比例