针对上述问题，东南大学张天柱教授团队开发了3DPF贴片，其核心材料为4arm-PLGA-GPO（4A-GPO），由GPO肽序列与4armPLGA偶联合成，可增强生物活性和机械性能。贴片封装bFGF刺激细胞增殖和迁移，抗菌层由大黄素和妥布霉素组成。体内研究显示，3DPF贴片减少纤维化和粘连，促进血管生成和胶原蛋白沉积，调节免疫反应加速组织修复。转录组学分析显示，贴片下调IL-17介导的炎症途径，上调细胞粘附分子相关途径。分子对接研究表明，贴片与VEGF和COL3等关键分子相互作用，增强血管生成和基质重塑。相关成果于2025年5月2日以《Collagen-Inspired 3D Printing Electrospinning Biomimetic Patch for Abdominal Wall Defect Regeneration》发表在《Advanced Fiber Materials》（DOI：10.1007/s42765-025-00547-4）。

研究示意图

(1) 4A-GPO 的设计与表征

通过固相肽合成（SPPS）方法合成GPO三肽。图1a展示了将GPO三肽共轭到4A聚合物上的合成路线。图1b显示GPO化学结构由甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸组成。图1c的圆二色性（CD）光谱在220 nm附近呈现负峰，表明存在β-转角结构。图1d显示不同浓度GPO的紫外-可见吸收光谱，吸光度随浓度增加而上升。图1e展示了4A-GPO的结构，表明GPO成功共轭到4A上。图1f的¹H-NMR光谱和图1g的FTIR光谱进一步验证了4A-GPO的化学结构。图1h的热重分析（TGA）显示GPO在约200°C下稳定，4A在约280°C下稳定。图1i和j的溶血试验显示4A-GPO的溶血率低于5%，表明其生物相容性良好。

图1 4A-GPO的合成与表征。（a）4A-GPO的设计；（b）GPO的分子结构；（c）GPO的CD光谱；（d）GPO的紫外-可见光谱；（e）4A-GPO的分子结构；（f）4A、GPO和4A-GPO的¹H-NMR光谱；（g）4A、GPO和4A-GPO的FTIR光谱；（h）4A、GPO和4A-GPO的TGA光谱；（i）和（j）4A和4A-GPO的体外溶血实验

（2）乳液纳米纤维支架的设计与表征

图2a展示了bFGF@4A-GPO的制备过程，bFGF通过W/O乳液法封装在4A-GPO中形成纳米纤维支架。图2b显示4A-GPO组细胞密度高于对照组，表明其促进细胞黏附，且bFGF@4A-GPO组细胞数量更多，定量分析也证实了这一点（图2c），说明bFGF进一步促进细胞增殖。图2d显示bFGF@4A-GPO组细胞迁移能力最强，伤口闭合率约85%，显著高于其他组。图2f的活/死染色显示4A-GPO和bFGF@4A-GPO组活细胞数量显著增加。图2g的DPPH清除结果表明4A-GPO中抗氧化成分中和了更多自由基，bFGF@4A-GPO活性最高，接近150%。图2h显示bFGF@4A-GPO组L929细胞存活率最高，显著优于其他组。

图2 bFGF@4A-GPO的制备及表征。（a）bFGF@4A-GPO的制备及乳液纳米纤维支架的制造流程；（b）贴片上培养的L929细胞的光学图像；（c）细胞数量定量结果；（d）划痕试验的荧光染色图像；（e）伤口闭合百分比；（f）贴片上培养24小时的L929细胞的活/死染色分析；（g）DPPH的紫外-可见光谱；（h）与贴片共培养不同时间后L929细胞的存活率

（3）3DPF 贴片的制备与表征

图3a展示了仿生3DPF贴片的制备流程：先用PCL和Lys通过3D打印构建宏观支架结构，再通过乳液静电纺丝技术在支架上制备含bFGF@4A-GPO的修复层，最后涂覆包含大黄素和妥布霉素的抗菌层。图3b为3D打印层的SEM图像，显示纤维直径分布均匀。图3c统计显示，3D打印层平均纤维直径约625.9μm，多在500–700μm范围内，有助于维持结构完整性和生物学功能，促进细胞渗透并提供机械支撑。修复层水接触角为67.8°（图3d），亲水性利于液体渗透、GPO/bFGF释放及细胞黏附增殖，其平均纤维直径209.3nm（图3e），纤细结构及高表面积体积比利于细胞附着。抗菌层水接触角128.8°（图3f），疏水性可保护结构免受水分侵蚀，避免抗菌效能下降，平均纤维直径416.9nm（图3g）。图3h对比P贴片与3DPF贴片的力学性能应力-应变曲线：P贴片延展性好，可承受高达700%的应变，应力峰值约3.5MPa；3DPF贴片在应变约160%时应力达9MPa左右，延展性和强度均优于P贴片，多层结构提升了力学性能，满足强度与柔韧性的平衡需求。图3i的光学图像显示3DPF贴片宏观形态均匀，弯曲不断裂，兼具微观结构功能性与宏观结构稳定性，对生物应用中的实际效能至关重要。

图3 3DPF贴片的制备与表征。（a）通过3D打印和静电纺丝技术制备3DPF贴片的示意图；（b）顶层（3D打印层）的SEM图像及水接触角观测；（c）顶层纤维直径统计结果；（d）层（抗菌层）的SEM图像及水接触角观测；（g）底层纤维直径统计结果；（h）P贴片与3DPF贴片的力学性能对比；（i）3DPF贴片的柔韧性展示

（4）3DPF 贴片的体外生物相容性与抗菌性能

图4a展示了3DPF贴片与细胞共培养的示意图。图4b为3DPF贴片与细胞共培养的光学显微镜图像。3D打印层构建了支架的整体形态和多孔结构，对细胞浸润和营养物质运输至关重要。纳入具有特定生物活性的纳米纤维（如bFGF@4A-GPO）可模拟细胞外基质（ECM），增强细胞黏附、迁移和分化。图4c通过分子对接分析揭示了3DPF材料与整合素之间的相互作用机制。图4d、e和f展示了3DPF在不同时间点（24小时和72小时）对细胞增殖的影响，与对照组相比，3DPF显著提高了细胞存活率和增殖率。活/死染色结果显示，3DPF组细胞密度和形态更均匀，活细胞活性的绿色荧光强度显著增强。图4g展示了3DPF对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果，其通过释放EMO和妥布霉素以及疏水性表面结构抑制细菌生长。图4h的琼脂扩散实验结果显示，3DPF在琼脂平板上形成了明显的抗菌区。图4i的抗菌活性平板计数实验结果显示，与对照组相比，经3DPF处理后细菌菌落数量显著减少，两种细菌的生长均被完全抑制。

图4 3DPF贴片的细胞培养与抗菌性能。（a）3DPF贴片引导细胞生长的示意图；（b）在3DPF贴片上培养的L929细胞的光学图像；（c）基于能量最小化的整合素与GPO组装的分子对接图像；（d）在3DPF贴片上培养24小时和72小时的L929细胞的光学图像；（e）在贴片上培养24小时和72小时的L929细胞的活/死染色分析；（f）与贴片共培养24小时、48小时和72小时后L929细胞的存活率；（g）3DPF贴片抗菌性能的示意图；（h）3DPF贴片的抗菌环试验；（i）用3DPF贴片处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液的琼脂平板照片

（5）3DPF 贴片在腹壁缺损模型中的治疗效果

图5a为实验设计概述，大鼠在D0接受腹壁缺损手术，切口长度10mm，分别在D7、D14和D30收集组织样本。图5b展示了使用四种贴片（对照组、P贴片、3DP贴片和3DPF贴片）治疗的大鼠腹壁修复愈合进程。D7时，对照组修复程度最低且存在粘连，而其他三组未出现粘连，3DPF贴片组伤口部位血管生成增加。D14时，对照组仍存在粘连，其他三组表面光滑，3DPF贴片组修复平整且无粘连。D30时，对照组因过度修复形成粘连，其他三组愈合情况改善，3DPF贴片组形成新的光滑腹膜，且在任何时间点均未出现粘连。

图5c显示小鼠术后恢复期间体重逐渐增加，表明材料未引起显著毒性或全身性不良反应。图5d为30天后贴片植入区域的粘连评分，对照组评分最高，P贴片组次之，3DP贴片和3DPF贴片组评分最低，3DPF贴片组在减少粘连方面显著优于其他组。

图5e的H&E染色结果显示，对照组存在粘连、大量中性粒细胞聚集和炎症浸润，纤维分布松散不均匀；P贴片组有一定愈合潜力，但存在轻度炎症；3DP贴片组组织愈合改善，炎症减轻；3DPF贴片组组织愈合完全，炎症反应显著减少，且有细胞增殖、胶原沉积和新生血管形成。

图5f的Masson染色结果显示，对照组胶原纤维排列紊乱、密度低；P贴片组纤维化和胶原沉积减少；3DP贴片组纤维结构略有改善；3DPF贴片组胶原纤维排列规则、密度增加，定量结果表明其胶原密度最高。

图5g的天狼星红染色结果显示，随着时间推移，对照组和P贴片组中I型胶原占主导，P贴片组胶原表达高于对照组。图5h的免疫荧光分析显示，与对照组相比，P贴片组的CD31和Ki67表达增加；3DP贴片组CD31表达进一步上升；3DPF贴片组CD31和Ki67表达最高，显著促进血管生成和细胞增殖。

图5i的免疫组织化学分析显示，对照组TNF-α和IL-6信号较强，P贴片组信号减弱，3DP贴片组进一步减弱，3DPF贴片组信号最弱，炎症显著减少。这些结果表明，3DPF贴片有效减少了粘连形成、胶原沉积、血管生成、细胞增殖和炎症，且未对小鼠正常生长产生负面影响，是治疗腹壁缺损的有前途的抗粘连材料。

图5 腹壁缺损修复实验结果。（a）腹壁缺损实验设计示意图；（b）不同贴片治疗的腹壁缺损照片；（c）修复后大鼠的体重变化；（d）粘连形成评估；（e）H&E染色的组织学图像；（f）M&T染色及切片中胶原的定量分析；（g）天狼星红染色图像及胶原沉积定量分析；（h）免疫荧光染色评估（蓝色：DAPI，红色：CD31，绿色：Ki67）及定量分析；（i）IL-6和TNF-α免疫组化染色分析及定量分析

（6）3DPF 贴片组织修复的潜在机制

图6a展示了各组中iNOS（M1型标志物，绿色）和CD206（M2型标志物，红色）的表达情况，结果显示3DP和3DPF组显著向M2型极化，而对照组和P组含有更多M1型巨噬细胞。图6b的统计分析表明，iNOS阳性细胞显著减少，CD206阳性细胞增加，3DPF组最为明显，说明3DPF可促进巨噬细胞向M2型极化。图6c阐释了巨噬细胞极化机制，M1型诱导炎症反应，M2型介导抗炎与修复功能，分子对接显示GPO通过与CD206的特定位点形成氢键，增强M2型极化及其抗炎作用。

图6d的火山图显示3DPF组中有853个基因上调、648个基因下调，表明其在基因水平上对组织修复相关过程进行了广泛调控。图6e的热图突出显示了3DPF诱导的独特转录组变化。图6f的KEGG通路富集分析发现，3DPF显著参与吞噬作用、MAPK信号传导和细胞黏附等通路。图6g的GO富集分析进一步将3DPF的作用与组织修复和再生相关功能联系起来。

图6h的GSEA分析显示，IL-17信号通路的富集分数为负值（NES=-2.18），表明该通路受到抑制，3DPF组的促炎环境得到改善；细胞黏附分子通路高度激活（NES=2.0053），提示细胞黏附、迁移和细胞外基质重塑能力增强。

图6i通过分子对接分析展示了3DPF组与关键分子（包括COL3、肌动蛋白和VEGF）的作用机制，表明3DPF可通过与这些分子结合来增强其生物活性或稳定性，从而促进组织修复的多种机制，尤其是在伤口愈合、软组织修复和血管生成方面。

图6 3DPF补片在组织修复中的潜在机制。（a）CD206、iNOS的免疫荧光染色及（b）定量分析；（c）巨噬细胞极化示意图及基于能量最小化的CD206与GPO组装的分子对接图像；（d）差异表达基因火山图；（e）层次聚类分析后表达水平热图；（f）KEGG通路富集分析；（g）3DPF组与对照组之间差异表达基因的功能注释；（h）IL-17信号通路和细胞黏附分子的GSEA图；（i）基于能量最小化的COL3、Actin和VEGF与GPO组装的分子对接图像