针对上述问题，内华达大学拉斯维加斯分校Chandrabali Bhattacharya教授开发了一种名为内源靶向脂质纳米颗粒（ENDO）的新平台，通过在LNP配方中加入内源性配体（如维生素）作为第五组分，调节其器官趋向性并增强靶向递送能力。研究筛选了100种不同配方的LNPs，这些配方包含多种内源性维生素、不同的离子化脂质和独特的配方比例，以评估其组织特异性递送潜力。结果发现，两种含有胆钙化醇作为第五组分的配方（C-CholF2和C-CholF3）可通过静脉注射实现对胰腺的高选择性mRNA递送，其中C-CholF3在胰腺的蛋白表达效率更高，具有超过99%的选择性和长达3天的持续表达能力。研究推测其胰腺趋向性可能与维生素D受体（VDR）介导的内源靶向机制有关。此外，C-CholF3还可用于递送其他核酸载荷，包括质粒DNA和环状mRNA，且具有较低的毒性、更好的安全性和耐受性。在Ai14小鼠模型中，C-CholF3 LNP还实现了胰腺的组织特异性基因编辑。该研究证明了将内源性维生素作为LNP第五组分的重要性，并为靶向难以到达的肝脏外器官（如胰腺）提供了新的策略，有望用于治疗目前无法治愈的胰腺疾病。该文章于2025年6月12日以《Reengineering Endogenous Targeting Lipid Nanoparticles (ENDO) for Systemic Delivery of mRNA to Pancreas》为题发表于《Advanced Materials》上（（DOI：10.1002/adma.202507657）。

图1 第五组分ENDO LNP制剂及筛选平台概览。（a）目前开发肝外递送系统面临的挑战示意图；（b）ENDO LNP制剂及筛选平台示意图；（c）不同制剂比例的饼状图，包括可离子化脂质、磷脂、胆固醇、PEG脂质和内源性维生素第五组分

（1）ENDO LNPs 的体外筛选

传统mRNA递送用的脂质纳米颗粒（LNPs）由四种关键成分组成：离子化脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇脂质。为增强LNPs的器官特异性递送能力，研究中加入了维生素A、B2、D3、E和K1作为第五组分。开发了一个全面的配方库，使用了SM-102、MC3、C12-200、THP1和306Oi10等离子化脂质，基于基准配方（摩尔比为35:16:46.5:2.5）设计了四种不同配方比例，并系统研究了维生素摩尔比对LNPs性能的影响（图1C）。通过手工混合在96孔板中制备了100种不同配方的LNPs，结合了五种离子化脂质、五种维生素和四种配方比例。动态光散射（DLS）测量显示，大多数LNPs的平均直径在60~140 nm之间，PDI小于0.2，与传统LNPs结构相似。

在多种细胞系（HEK293、HFF、HUVEC、RAW264.7和HMC3）中评估了所有LNPs的体外转染效率。结果表明，与对照组MC3和SM-102相比，ENDO LNPs的转染效率显著提高。例如，在HEK293细胞中，以视黄醇、核黄素和叶绿醌为第五组分的LNPs转染效率更高（图2A）；在HFF细胞中，以视黄醇、核黄素和生育酚为第五组分的SM-102 LNPs转染效率更高（图2B）；在HUVEC细胞中，C12-200和306Oi10为基础的LNPs表现出更高的转染效率（图2C）；在RAW264.7细胞中，C12-200为基础的LNPs转染效率更高（图2D）；在HMC3细胞中，以视黄醇、核黄素和叶绿醌为第五组分的C12-200 LNPs转染效率更高（图2E）。这些结果表明，将维生素作为第五组分加入ENDO LNPs可以显著提高转染效率，为实现组织特异性递送提供了依据。

图2 ENDO LNPs的体外筛选。（a）在HEK293细胞中体外递送荧光素酶mRNA的热图（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），处理24小时后量化发光强度；（b）在HFF细胞中体外递送荧光素酶mRNA的热图（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），处理24小时后量化发光强度；（c）在HUVEC细胞中体外递送荧光素酶mRNA的热图（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），处理24小时后量化发光强度；（d）在RAW 264.7细胞中体外递送荧光素酶mRNA的热图（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），处理24小时后定量分析发光强度；（e）在HMC3细胞中体外递送荧光素酶mRNA的热图（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），处理24小时后定量分析发光强度。缩写：T1，THP1；C12，C12-200；SM，SM-102；306，306Oi10；F1，配方1；F2，配方2；F3，配方3；F4，配方4

（2）使用批量分析进行ENDO LNPs体内筛选

通过综合批量分析评估了ENDO LNPs的体内递送效率。研究将100种LNPs按配方比例分为四组（F1、F2、F3和F4），每组包含25种配方。这些LNPs以0.5 mg·kg⁻¹的剂量静脉注射到C57BL/6小鼠体内，通过IVIS成像系统检测主要器官的蛋白表达。结果显示，F1和F4主要在肝脏表达，并在脾脏、肠道和胰腺有少量表达；F2和F3则显著重定向到肝脏外，其中F2在胰腺表现出选择性蛋白表达，而在其他器官（包括脾脏和肝脏）表达极少（图3A）。随后，基于离子化脂质（THP1、C12-200、SM-102、MC3和306Oi10）将F2和F3配方分为五组，每组10种LNPs进行注射。结果表明，C12-200组在胰腺表现出选择性转染，而其他离子化脂质组在多个器官均有表达（图3B）。进一步将C12-200配方按不同维生素（视黄醇、核黄素、胆钙化醇、生育酚和叶绿醌）分组，发现胆钙化醇配方在胰腺表现出选择性mRNA转染和蛋白表达（图3C）。在整个筛选过程中，SM-102和MC3作为对照，主要在肝脏积累。

图3 使用批量分析进行ENDO LNPs体内筛选。（a）注射后24小时的IVIS图像及基于配方（F1、F2、F3、F4）的FLuc mRNA ENDO LNP池总通量的图形表示，SM-102和MC3作为对照，C57BL/6小鼠静脉注射0.5 mg·kg⁻¹混合的ENDO LNPs（n=2只生物学独立小鼠，±SD）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肠和肾脏。（b）注射后24小时的IVIS图像及基于可离子化脂质的FLuc mRNA ENDO LNP池总通量的图形表示，靶向胰腺的F2和F3 LNPs按可离子化脂质（THP1、C12-200、SM-102、MC3、306Oi10）分批处理后静脉注射，SM-102和MC3作为对照（n=2只生物学独立小鼠，±SD）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肠和肾脏。（c）注射后24小时的IVIS图像及基于内源性维生素的FLuc mRNA ENDO LNP池总通量的图形表示，靶向胰腺的选择性C12-200 ENDO LNP按维生素A（视黄醇）、B2（核黄素）、D3（胆钙化醇）、E（生育酚）、K1（叶绿醌）分批处理后静脉注射，SM-102和MC3作为对照（n=2只生物学独立小鼠，±SD）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肠和肾脏

（3）ENDO LNP、C-CholF2 和 C-CholF3 的效果验证

使用微流控装置制备了C12-200胆钙化醇F2（C-CholF2）和C12-200胆钙化醇F3（C-CholF3）LNPs。C-CholF2和C-CholF3的粒径和包封率（EE%）测量结果显示，两者粒径相似且EE%较高，表明mRNA包封效果良好（图4A）。将C-CholF2和C-CholF3以0.5 mg·kg⁻¹的剂量静脉注射到C57BL/6小鼠体内，C-CholF3和C-CholF2在胰腺表现出选择性表达，C-CholF3的平均总通量为1.04×10⁸，是C-CholF2（2.29×10⁷）的4.5倍，表明C-CholF3能够以更高的效率靶向胰腺（图4B）。通过腹腔注射途径评估了C-CholF3的效率，平均总通量降低到5.94×10⁶（约为静脉注射信号的12%），但对胰腺的选择性仍超过99%。C-CholF3 ENDO LNPs的低温电子显微镜（cryo-EM）图像显示其呈球形，具有多层膜壳包裹的非晶态核心（图4D）。将0.25、0.5和1 mg·kg⁻¹的C-CholF3 LNPs静脉注射到C57BL/6小鼠体内，观察到明显的剂量依赖性转染效率提升。

图4 顶级ENDO LNP（C-CholF2和C-CholF3）的验证。（a）C-CholF2和C-CholF3及对照（C12-200）的物理化学特性，包括尺寸、PDI、ζ电位和mRNA包封效率（n=3，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，NS表示不显著，采用单因素方差分析及Bonferroni事后分析）。（b）注射后24小时的代表性IVIS图像及静脉注射0.5 mg·kg⁻¹的C-CholF2和C-CholF3 ENDO LNP总通量的图形表示，PBS和C12-200作为对照（n=3只生物学独立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，NS表示不显著，采用单因素方差分析及Bonferroni事后分析）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肠和肾脏。（c）饼图显示静脉注射C12-200（传统四组分）并重定向至胰腺后，C-CholF2和C-CholF3 LNPs在各器官的蛋白表达百分比（n=3只生物学独立小鼠）。（d）C-CholF3 LNPs的代表性低温电子显微镜图像，比例尺为50纳米

（4）C-CholF3 ENDO LNPs的毒性和安全性评估

C-CholF3的体内生物相容性研究显示，其处理的胰腺组织在24小时和48小时后H&E染色未见形态学损伤或炎症反应（图5A），胰岛细胞保持完整，无坏死或退行性变化；肝脏组织在48小时后H&E染色也未见显著差异。连续监测21天体重和血液学参数发现，小鼠体重无显著下降，肝酶（ALT、AST、碱性磷酸酶）水平正常，未观察到肾脏毒性（图5B）。注射后24小时检测的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平与PBS对照组相当，表明LNP低免疫原性（图5C），其他免疫生物标志物水平也与对照组相当，适合LNP的重复给药。这些结果表明，C-CholF3 ENDO LNPs具有更高的生物相容性和更低的毒性，优于传统C12-200 LNPs。

C-CholF3 LNPs在4℃和-20℃下储存1、3、7和21天后，物理化学性质变化极小，粒径、PDI、ζ电位和EE%等参数保持一致。即使在无冷冻保护剂的情况下储存21天，LNPs仍能保持稳健的荧光素酶（FLuc）表达，表明其具有卓越的稳定性，适合长期储存和运输。此外，静脉注射C-CholF3 LNPs到C57BL/6小鼠体内后，生物发光信号在72小时内保持稳健（图S14，补充信息），表明其在体内具有较长的稳定性和表达时间。

通过TNS实验发现，靶向胰腺的C-CholF3 LNPs的表观pKa值为7.31，高于靶向肝脏的C12-200 LNPs的pKa值6.71。C-CholF3 LNPs能够递送多种核酸载荷，包括质粒DNA和环状mRNA。静脉注射含有环状mRNA或质粒DNA的C-CholF3 LNPs后，环状mRNA的平均总通量为8.41×10⁷，质粒DNA为1×10⁸，且两者的选择性均超过99%，表明其对不同核酸具有广泛的兼容性。质粒DNA可实现长期基因表达，环状mRNA则具有更高的稳定性和更低的免疫原性。总体而言，C-CholF3 LNPs是一种安全且高效的胰腺靶向核酸治疗递送方法，对胰腺癌和糖尿病治疗具有重要意义。

图5 C-CholF3 ENDO LNPs的毒性和安全性评估。（a）C57BL/6小鼠静脉注射包裹FLuc mRNA的C-CholF3和PBS（对照，剂量0.5 mg·kg⁻¹）后，胰腺（处理后24和48小时）和肝脏切片（处理后48小时）的代表性组织学图像，苏木精-伊红（H&E）染色，放大倍数40倍，比例尺60 µm（n=3只生物学独立小鼠）。（b）静脉注射PBS、C-CholF3和C12-200 LNPs（剂量0.5 mg·kg⁻¹）后24小时，血清肝酶（丙氨酸氨基转移酶ALT和天冬氨酸氨基转移酶AST）、肾脏参数（血尿素氮BUN和肌酐）水平（n=3，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；NS表示不显著，采用单因素方差分析和Bonferroni事后分析）。（c）以0.5 mg·kg⁻¹剂量静脉注射C-CholF3和C12-200 LNPs的小鼠体内IL-6、IL-1β和TNFα水平（n=3只生物学独立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；NS表示无显著性，采用单因素方差分析和Bonferroni事后分析），以注射PBS的小鼠作为对照组

（5）C-CholF3 ENDO LNPs 内源性靶向胰腺的机制探究

C-CholF3 ENDO LNPs实现胰腺选择性递送的机制研究结果如下：共聚焦显微镜观察显示，DiO标记的C-CholF3 LNPs在BxPC-3细胞中处理2小时后与LysoTracker标记的内体/溶酶体明显共定位，表明其有效内化和内质网运输（图6A）。C-CholF3处理的细胞DiO荧光强度显著高于MC3处理的细胞，提示其细胞摄取能力更强，推测与受体介导的内化途径有关。由于C-CholF3配方中含有胆钙化醇作为第五组分，推测其可能通过与维生素D受体（VDR）的相互作用实现胰腺细胞的选择性摄取。

在体内研究中，使用VDR的拮抗剂MeTC7预处理C57BL/6小鼠（50 mg·kg⁻¹），12小时后静脉注射包裹Fluc mRNA的C-CholF3 ENDO LNPs（0.5 mg·kg⁻¹）（图6B）。注射后24小时的IVIS成像显示，PBS处理的小鼠胰腺中荧光素酶表达强烈，证实了C-CholF3的胰腺靶向性（图6C），而MeTC7预处理的小鼠胰腺信号完全消失，表明功能性VDR对组织选择性递送至关重要，MeTC7破坏了VDR与C-CholF3 LNPs的相互作用。此外，MC3 LNPs在MeTC7处理的小鼠中仍表现出强烈的肝脏蛋白表达，符合ApoE介导的肝脏靶向机制。

进一步验证VDR的作用，将MeTC7作为第五组分替代胆钙化醇，制备了靶向胰腺的LNPs。以0.5 mg·kg⁻¹的剂量静脉注射MeTC7 LNPs后，24小时的IVIS成像显示胰腺中选择性且强烈的荧光素酶表达（图6D），表明MeTC7嵌入LNP后可与VDR相互作用，类似于胆钙化醇，从而促进高效的胰腺靶向。这进一步证实了LNP与VDR之间的直接相互作用，支持了一种新的VDR介导的递送机制。

图6 C-CholF3 ENDO LNPs内源性靶向胰腺的机制探究。（a）共聚焦显微镜图像显示DiO标记的C-CholF3和MC3 LNPs在BxPC-3细胞中的摄取和细胞内运输情况。细胞用LysoTracker Red（内体/溶酶体）和Hoechst 33342（细胞核）染色，处理后2小时成像以观察纳米颗粒定位，比例尺10 µm，放大60倍（n=3）。（b）使用MeTC7阻断VDR的示意图。小鼠腹膜内注射50 mg·kg⁻¹ MeTC7，12小时后静脉注射mRNA LNPs。（c）为研究VDR作用，小鼠在注射LNP前12小时预先注射VDR拮抗剂MeTC7或PBS（对照）。C57BL/6小鼠静脉注射LNP（0.5 mg·kg⁻¹）后24小时的代表性IVIS图像（n=4只生物学独立小鼠）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肾脏和肠道。（d）代表性IVIS图像、总通量的图形表示和饼图，说明注射C-CholF3 LNP（以MeTC7代替胆钙化醇作为第五种成分）后24小时各器官的蛋白表达百分比。小鼠接受静脉注射，剂量为0.5 mg·kg⁻¹（n=3只生物学独立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS表示不显著，采用双尾非配对t检验）。器官从左到右依次为：心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肾脏和肠道

（6）利用 C-CholF3 ENDO LNPs 在胰腺中高效且组织特异性地表达 tdTomato

利用Ai14小鼠模型评估了C-CholF3 LNPs的组织特异性基因编辑能力。该模型含有Cre介导基因编辑的构建，CAG启动子下游有LoxP-stop-LoxP盒，成功递送Cre重组酶后可激活tdTomato荧光（图7A）。将包裹Cre重组酶mRNA的C-CholF3 LNPs以1.5 mg·kg⁻¹的剂量静脉注射到Ai14小鼠体内，120小时后荧光成像显示胰腺中tdTomato表达强烈，选择性超过99%（图7B、图7C），而其他组织荧光不显著。免疫荧光分析显示，胰岛素抗体染色的β细胞中出现tdTomato荧光，表明C-CholF3 ENDO LNPs在胰腺β细胞中实现了有效的基因编辑（图7D），但这种递送并非仅限于β细胞。这些结果表明，该递送系统能够调节胰腺主要细胞类型的基因表达，有望用于胰腺疾病的靶向治疗。

为了评估C-CholF3 LNPs的临床转化潜力，将其安全性与已获批的MC3配方（Onpattro）进行了比较。在注射后4小时和24小时评估了C-CholF3和MC3的体内转染效率和毒性特征。IVIS成像显示，C-CholF3在4小时时已在胰腺积累，平均总通量为3.52×10⁶，且在肝脏清除后未发生再分布；而MC3主要在肝脏积累，平均总通量为2.26×10⁷。24小时时，IVIS图像显示C-CholF3在胰腺的转染效率高于MC3，平均总通量分别为3.47×10⁷和3.24×10⁷。安全性评估表明，C-CholF3的血清肝酶ALT和AST水平低于MC3，两者对肾脏功能参数影响相似，且C-CholF3的细胞因子谱更优，其中IL-6水平显著低于MC3，而IL-1β水平高于MC3，总体支持C-CholF3具有更优的安全性。

图7 利用C-CholF3 ENDO LNPs在胰腺中高效且组织特异性地表达tdTomato。（a）Cre mRNA递送及Cre介导的终止盒移除示意图，激活Ai14 Cre-loxP小鼠模型中的tdTomato表达，通过静脉注射含Cre mRNA的LNPs并使用IVIS成像胰腺。（b）注射后120小时胰腺中tdTomato的代表性表达及含Cre mRNA的C-CholF3 LNPs总通量的图形表示，以及以1.5 mg·kg⁻¹剂量静脉注射到Ai14小鼠的PBS处理对照（n=4只生物学独立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS表示不显著，采用双尾非配对t检验）。（c）饼图说明静脉注射含Cre mRNA的C-CholF3 LNPs后胰腺和肝脏中蛋白表达的百分比（n=4只生物学独立小鼠）。（d）Ai14小鼠静脉注射1.5 mg·kg⁻¹剂量的包裹Cre mRNA的C-CholF3 LNPs和PBS（对照）后120小时胰腺切片的代表性免疫荧光图像，使用胰岛素抗体对β细胞染色，DAPI标记细胞核，图像采集自三只生物学独立小鼠，放大40倍