针对上述问题，山东大学齐鲁医学院药学院张志岳教授团队开发了一种ROS响应型药物纳米载体（PHD/G-NPs），由聚合物-药物缀合物自组装而成，能够包裹GSI。该载体在T-ALL细胞内化后，通过ROS敏感桥的降解，快速释放GSI和DHA。GSI抑制Notch1信号通路，抑制细胞增殖，而DHA则通过铁死亡进一步增强细胞毒性。此外，铁死亡过程中释放的损伤相关分子模式（DAMPs）与αPD-1联合使用，可激活免疫反应，增强抗肿瘤效果。为了降低GSI的副作用，研究人员进一步用CD38抗体修饰纳米载体，提高了治疗效果和安全性(图1)。相关研究在2025年5月31日以《A ROS-Responsive Dual-Targeting Drug Nanocarrier Serving as a GSI Synergist and Ferroptosis Sensitizer for T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202505087）上。

图1 研究示意图

（1）DHA增强GSI对T-ALL细胞的细胞毒性

在T-ALL细胞系中，单独使用GSI对细胞增殖的抑制效果不显著（图2A），这可能是由于其水溶性低。通过DCFH-DA监测GSI处理的Molt4和Jurkat细胞内ROS水平，发现ROS水平随时间逐渐升高（图2B、C）。在GSI处理后，联合使用DHA显著增强了对T-ALL细胞的细胞毒性。在最大测试浓度下，GSI单独处理时Molt4和Jurkat细胞的抑制率分别为17.9%和33.9%，而DHA单独处理时Molt4的抑制率为41.8%，其在Jurkat中的半抑制浓度（IC50）为28.78 µm。然而，GSI与DHA联合使用时，GSI的IC50在Molt4和Jurkat中分别降低至14.2 µm和19.83 µm（图2D、E），表明DHA显著增强了GSI的细胞毒性。进一步实验表明，T-ALL细胞先用GSI预处理，再联合DHA处理时，细胞存活率进一步降低，IC50值分别降至10.07 µm（Molt4）和12.36 µm（Jurkat）。这表明GSI预处理比同时给药更有效地增强T-ALL细胞对DHA的敏感性。推测GSI通过抑制Notch1激活诱导T-ALL细胞短暂生长停滞，部分ROS水平高的半静止细胞在GSI处理后存活，其ROS水平升高，从而增强DHA的细胞毒性（图2F）。

图2 DHA增强GSI对T-ALL细胞的细胞毒性。(a) 不同浓度GSI处理T-ALL细胞的增殖活性；(b) GSI（20 µm）处理T-ALL细胞不同时间点的ROS水平流式细胞术分析；(c) (b)中ROS检测的平均荧光强度（MFI）定量；(d, e) Molt4（d）和Jurkat（e）细胞经不同处理后的细胞活性（CCK8法）：单独GSI处理24小时、单独DHA处理24小时、GSI+DHA联合处理24小时、先GSI预处理24小时再与DHA共处理24小时；(f) DHA与GSI协同作用机制示意图

（2）ROS响应性NP的成功制备

基于pDMA-pEPEMA-pHD聚合物的ROS响应性，通过纳米沉淀法制备了ROS响应型纳米颗粒（PHD/G-NPs），如图3A所示。利用动态光散射（DLS）测得PHD/G-NPs的平均粒径为134.7 ± 2.1 nm，分布均匀（PDI：0.25 ± 0.014），zeta电位为−3.16 ± 0.52（图3B、D、E）。透射电子显微镜（TEM）观察结果显示，纳米颗粒呈球形且分散良好，证实纳米颗粒成功制备（图3C）。为评估ROS响应性，将纳米颗粒置于含1 mM H₂O₂的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中孵育，结果显示纳米颗粒结构被破坏，zeta电位发生变化，表明其对ROS具有响应性（图3E、F）。此外，采用动态膜透析法研究DHA的体外释放行为，结果显示在含1 mM H₂O₂的PBS中，DHA的累积释放率达到82.16 ± 3.43%，而在不含H₂O₂的PBS中仅为46.94 ± 1.9%（图3G），证实了纳米颗粒的ROS触发释放特性（图3H）。

图3 PHD/G-NPs和CD38-PHD/G-NPs的制备与表征。(a) PHD/G-NPs制备示意图；(b) PHD/G-NPs的粒径分布（DLS检测）；(c) PHD/G-NPs的代表性TEM图像；(d) PHD/G-NPs的粒径、PDI和zeta电位值；(e) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H₂O₂）中孵育后的zeta电位变化；(f) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H₂O₂）中孵育后的TEM图像；(g) PHD/G-NPs在pH 7.4 PBS（含或不含1 mM H₂O₂）中孵育后DHA的体外释放曲线；(h) PHD/G-NPs的ROS响应性DHA释放示意图

（3）PHD/G-NPs体外抗白血病作用

在10 µm浓度下处理6小时后，纳米颗粒对细胞内ROS水平的影响显示，GSI-NPs的ROS水平显著高于BLANK-NPs，与游离GSI相当；PHD-NPs的ROS水平高于BLANK-NPs，与DHA诱导的氧化应激增强机制一致；PHD/G-NPs组的ROS水平最高，表明DHA与GSI的协同作用显著提升了ROS水平（图4A）。体外抗白血病活性评估结果显示，GSI-NPs对两种T-ALL细胞系的细胞毒性显著高于游离GSI，而PHD/G-NPs的抑制效果最强，其IC50值在Molt4细胞中为5.6 µm，在Jurkat细胞中为8.6 µm（图4B）。20 µm浓度的PHD/G-NPs处理后，两种T-ALL细胞系的细胞存活率最低（图4C–E）。此外，PHD/G-NPs诱导的细胞死亡主要表现为坏死而非早期凋亡（图4F、G），提示DHA的细胞毒性可能主要通过非凋亡机制发挥作用。

图4 PHD/G-NPs 在体外诱导细胞死亡的作用。(A) 通过流式细胞分析对 ROS 检测的 MFI 进行量化。(B) 通过 CCK8 分析测量用不同纳米粒子处理的 Molt4（左）和 Jurkat（右）细胞的细胞活力。*，与 GSI-NP 组相比。#，与 PHD-NP 组相比。(C) 用不同配方 (20 µ m ) 处理后对 T-ALL 细胞系进行代表性细胞死亡分析。(D,E) 统计直方图显示 (C) 中 Molt4 (D) 和 Jurkat (E) 细胞的活细胞百分比。(F,G) 统计直方图显示 (C) 中 Molt4 (F) 和 Jurkat (G) 细胞中坏死和早期凋亡的百分比

（4）PHD/G-NPs诱导促进性铁死亡的机制

为阐明PHD/G-NPs诱导细胞死亡的机制，对经PBS、GSI、GSI-NPs或PHD/G-NPs处理的Molt4细胞进行了RNA-Seq分析。结果显示，与PBS对照组相比，GSI、GSI-NPs和PHD/G-NPs组中Notch信号通路的正向调控基因（KAT2A、NOTCH1等）表达下调，而负向调控基因（DVL3、NUMB等）表达上调（图5A），表明GSI有效抑制了Notch1激活。KEGG通路富集分析显示，GSI-NPs组中PI3K-AKT信号通路被激活，而GSI-NPs和PHD/G-NPs组中MAPK信号通路富集，且PHD/G-NPs组中特异性富集铁死亡相关基因（图5B）。这表明DHA通过促进铁死亡增强GSI的细胞毒性，而GSI通过激活MAPK信号通路（铁死亡的已知调控因子）增强细胞对DHA诱导的铁死亡的敏感性。进一步实验中，用MAPK抑制剂（SB202190）处理PHD/G-NPs组的T-ALL细胞，透射电镜观察到典型的铁死亡超微结构特征，如线粒体体积缩小、膜密度增加和嵴消失，这些变化在PHD/G-NPs处理的细胞中更为显著，而MAPK抑制剂则使线粒体形态恢复至接近正常状态（图5C）。此外，PHD/G-NPs显著增加了细胞内脂质ROS水平（BODIPY-C11染色，图5D）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平（图5E），而MAPK抑制剂则显著降低了这两者的水平。铁离子（Fe²⁺）水平的免疫荧光分析结果也与上述发现一致（图5F）。这些结果证实，GSI通过激活MAPK信号通路增强DHA诱导的铁死亡，从而弥补其自身细胞毒性不足。

图5 PHD/G-NPs诱导T-ALL细胞的细胞毒性机制。(a) 不同处理组（PBS、GSI、GSI-NPs、PHD/G-NPs）处理Molt4细胞后的Notch信号通路相关基因表达热图；(b) GSI、GSI-NPs和PHD/G-NPs处理组与对照组相比的差异基因KEGG通路富集分析结果；(c) 经PHD/G-NPs处理及MAPK抑制剂（SB202190）预处理后的T-ALL细胞的透射电镜图像，显示线粒体形态变化；(d) PHD/G-NPs处理及MAPK抑制剂预处理后的T-ALL细胞内脂质ROS水平检测（BODIPY-C11染色）；(e) PHD/G-NPs处理及MAPK抑制剂预处理后的T-ALL细胞内MDA水平检测； (f) PHD/G-NPs处理及MAPK抑制剂预处理后的T-ALL细胞内Fe²⁺水平免疫荧光分析

（5）PHD/G-NPs体内抗白血病作用

在Notch1诱导的T-ALL小鼠模型中，通过尾静脉注射给药（GSI 30 mg/kg，GSI与DHA摩尔比为1:1），评估了纳米颗粒的抗白血病活性（图6A）。结果显示，游离GSI和DHA联合治疗显著减小了脾脏的体积和重量，而PHD/G-NPs在抑制脾肿大方面效果优于单独的GSI-NPs或PHD-NPs（图6B、C）。此外，PHD/G-NPs处理后，脾脏和骨髓中GFP⁺白血病细胞的比例显著降低（图6D、E），表明PHD/G-NPs具有最高的抗白血病活性。对主要器官进行H&E染色的组织形态学分析显示，与对照组相比，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未观察到明显异常或病理变化（图6F），表明PHD/G-NPs具有良好的体内安全性。通过H&E和PAS染色分析T-ALL小鼠的回肠组织，发现GSI组分诱导了明显的肠道分泌化生，表现为杯状细胞数量显著增加（图6G）。所有接受GSI、GSI+DHA、GSI-NPs和PHD/G-NPs处理的小鼠均表现出杯状细胞数量升高，提示PHD/G-NPs需要靶向递送机制以选择性地作用于T-ALL细胞，减少非靶向效应。在Notch1诱导的T-ALL小鼠模型中，通过骨髓活检的免疫组化分析MDA和GPX4（铁死亡标志物），结果显示PHD-NPs和PHD/G-NPs处理的小鼠表现出显著的铁死亡活性，其中PHD/G-NPs组的铁死亡水平最高（图6H）。这些结果表明，PHD/G-NPs具有强大的抗白血病活性和铁死亡诱导能力，且在体内具有可接受的安全性，但无法预防GSI相关的肠道上皮损伤。

图6 PHD/G-NPs的体内抗白血病活性及安全性评估。(a) Notch1诱导的T-ALL小鼠模型给药方案示意图；(b) 不同处理组小鼠脾脏体积比较；(c) 不同处理组小鼠脾脏重量比较；(d) 不同处理组小鼠脾脏中GFP⁺白血病细胞比例；(e) 不同处理组小鼠骨髓中GFP⁺白血病细胞比例；(f) 主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色结果；(g) 不同处理组小鼠回肠组织的H&E和PAS染色结果；(h) 不同处理组小鼠骨髓中MDA和GPX4的免疫组化分析

（6）PHD/G-NPs与αPD-1联合在体内协同激活抗肿瘤免疫反应

文献曾报道PD-1表达与T-ALL的恶性进展呈正相关，且PD-1阻断可显著清除T-ALL干细胞并抑制肿瘤进展。铁死亡过程中释放的损伤相关分子模式（DAMPs）可重塑肿瘤微环境，而PHD/G-NPs已被证实能有效诱导铁死亡。因此，假设将PHD/G-NPs与PD-1抗体（αPD-1）联合使用可协同增强抗肿瘤效果。为此，建立了Notch1诱导的T-ALL小鼠模型，评估不同处理的抗白血病和免疫激活效果。小鼠通过尾静脉注射给予PBS、αPD-1、PHD/G-NPs或PHD/G-NPs+αPD-1联合治疗，共5次（图7A）。结果显示，联合治疗显著减小了脾脏体积，降低了脾脏和骨髓中GFP⁺白血病细胞的比例，效果优于PBS、αPD-1和PHD/G-NPs单独治疗组（图7B–E）。

进一步通过流式细胞术分析骨髓和脾脏中T细胞的激活情况。PHD/G-NPs+αPD-1组中，骨髓和脾脏中GFP⁻细胞的CD8⁺ T细胞比例显著高于其他各组（图7F、G、I、M），而CD4⁺ T细胞水平在各组间无显著差异（图7H、L）。此外，PHD/G-NPs+αPD-1治疗显著增强了体内树突状细胞（DC）的成熟，表现为GFP⁻细胞中成熟DC的比例高于其他组（图7J、N；）。同时，PHD/G-NPs+αPD-1处理还增加了骨髓和脾脏中自然杀伤（NK）细胞的积累（图7K、O）。

图7 PHD/G-NPs联合αPD-1在体内的抗肿瘤免疫反应。(A) Notch1诱导的T-ALL小鼠中不同治疗的实验方案：1，PBS（CON）；2，αPD-1；3，PHD/G-NP；4，PHD/G-NP联合αPD-1。(B，C) 四组脾脏大小照片（B）和脾脏重量对应的统计直方图（C）。(D) 流式细胞术分析脾脏中GFP+ T-ALL细胞百分比。E) 流式细胞术分析骨髓样本中GFP+细胞百分比。(F，G) 流式细胞术分析脾脏（F）和骨髓（G）中GFP-细胞中CD3+CD8+ T细胞百分比。 (H–K) 统计直方图显示脾脏中 GFP- 细胞中 CD3+CD4+ T 细胞 (H)、CD3+CD8+ T 细胞 (I)、CD86+CD80+ DC (J) 和 NK1.1+ NK 细胞 (K) 的百分比。L-O) 统计直方图显示骨髓中 GFP- 细胞中 CD3+CD4+ T 细胞 (L)、CD3+CD8+ T 细胞 (M)、CD86+CD80+ DC (N) 和 NK1.1+ NK 细胞 (O) 的百分比

（7）CD38-PHD/G-NPs在T-ALL CDX模型中的综合作用

为减轻GSI引起的严重胃肠道副作用，通过将CD38抗体与PHD/G-NPs结合进行修饰（图8A）。透射电镜（TEM）观察显示，修饰后的CD38-PHD/G-NPs呈球形且分散良好（图8B）。动态光散射（DLS）测量结果显示，CD38-PHD/G-NPs的平均粒径为153.4 ± 2.9 nm（图8C、E），分布均匀（PDI：0.238 ± 0.008，图8E），zeta电位为−1.99 ± 0.19 mV（图8F）。与未修饰的PHD/G-NPs相比，粒径和zeta电位的差异初步证实了CD38抗体的成功结合。红外光谱分析显示，CD38-PHD/G-NPs在1519 cm⁻¹处出现新的吸收峰，归属于CD38抗体的N–H弯曲振动（酰胺II带），进一步证实了纳米颗粒表面的CD38抗体修饰成功（图8D）。

为了评估CD38抗体修饰是否增强T-ALL细胞的体外摄取效率，使用荧光染料Cy5.5标记纳米颗粒并进行荧光显微镜和流式细胞术分析。结果显示，与未修饰的Cy5.5-NPs相比，CD38-Cy5.5-NPs处理的T-ALL细胞荧光强度显著增强，表明CD38修饰显著促进了T-ALL细胞的靶向摄取（图8G）。在体内分布方面，通过生物发光成像技术在T-ALL小鼠中监测CD38-Cy5.5-NPs的摄取情况，结果表明CD38-Cy5.5-NPs的摄取率显著高于其他配方（图8H），证实了其在体内的靶向效率更高。此外，体外成像研究显示，CD38-Cy5.5-NPs在T-ALL小鼠的骨髓和脾脏（白血病细胞富集部位）中的摄取更为显著（图8I）。流式细胞术分析显示，CD38-Cy5.5-NPs组骨髓细胞的平均荧光强度（MFI）显著高于其他组（图8J），表明CD38-Cy5.5-NPs优先靶向体内的白血病细胞。

在体内抗白血病效果方面，NSG小鼠移植Molt4细胞后，分别给予CD38-Blank-NPs、PHD/G-NPs和CD38-PHD/G-NPs处理，共5次（图8K）。结果显示，CD38-PHD/G-NPs在抑制脾肿大和降低脾脏及骨髓中GFP⁺白血病细胞比例方面效果最佳（图8L、M），且各组间体重无显著差异（图8N）。值得注意的是，接受CD38-PHD/G-NPs治疗的小鼠显示出接近正常的杯状细胞计数和保留的肠道上皮结构（图8O），表明减轻了GSI相关的胃肠道副作用。此外，生存监测显示，接受CD38-PHD/G-NPs治疗的Molt4荷瘤小鼠生存期最长（图8P）。这些数据证实，CD38-PHD/G-NPs通过抑制白血病进展和减轻严重胃肠道毒性，显著增强了联合治疗效果。由于NSG小鼠缺乏抗肿瘤免疫反应，与Notch1诱导的小鼠相比，CD38-PHD/G-NPs在Molt4荷瘤小鼠中的抗白血病效果有所降低。

图8 CD38-PHD/G-NPs的靶向递送效果评估。(a) CD38抗体修饰PHD/G-NPs的示意图；(b) CD38-PHD/G-NPs的TEM图像；(c) CD38-PHD/G-NPs的粒径分布；(d) CD38-PHD/G-NPs的红外光谱分析；(e) CD38-PHD/G-NPs的粒径和PDI值；(f) CD38-PHD/G-NPs的zeta电位值；(g) T-ALL细胞摄取CD38-Cy5.5-NPs的荧光显微镜图像；(h) T-ALL小鼠体内CD38-Cy5.5-NPs的生物发光成像结果；(i) 小鼠主要器官和骨髓的体外成像结果；(j) 骨髓细胞的流式细胞术分析结果；(k) NSG小鼠给药方案示意图；(l) 不同处理组小鼠脾脏体积比较；(m) 不同处理组小鼠脾脏和骨髓中GFP⁺白血病细胞比例；(n) 不同处理组小鼠体重变化；(o) 不同处理组小鼠回肠组织的H&E染色结果；(p) 不同处理组小鼠的生存曲线